真菌毒素免疫檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展-中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng)

     中國(guó)微生物菌種查詢網(wǎng) 真菌毒素，又稱(chēng)霉菌毒素，是指霉菌在其所污染食品中產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，可通過(guò)進(jìn)食進(jìn)入人或動(dòng)物體內(nèi)，引起人或動(dòng)物的急性或慢性中毒，進(jìn)而損害機(jī)體的肝臟、腎臟、神經(jīng)組織等。致癌性是真菌毒素對(duì)機(jī)體最嚴(yán)重和最普遍的危害。真菌毒素可在農(nóng)作物生長(zhǎng)或收獲時(shí)形成，也會(huì)因貯存條件的不適宜而產(chǎn)生。濕度或溫度高的環(huán)境通常有利于糧食和飼料中霉菌的生長(zhǎng)及其毒素的產(chǎn)生。真菌毒素最早于1960年被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時(shí)英國(guó)有10萬(wàn)只火雞死于該種疾病，后來(lái)鴨子也被波及�？茖W(xué)家很快在花生餅飼料中發(fā)現(xiàn)了“罪魁禍?zhǔn)?rdquo;：一種真菌產(chǎn)生的毒素，隨后被命名為“Aflatoxin”。從此以后，科學(xué)家投入了大量的時(shí)間和精力研究真菌毒素，并發(fā)現(xiàn)其主要包括以下幾個(gè)特點(diǎn)：
    ①低分子化合物：真菌毒素都是分子量小于1000的小分子化合物；
    ②對(duì)溫度非常穩(wěn)定，即使加熱到340℃也不會(huì)被分解和破壞；
    ③抗化學(xué)生物制劑及物理的滅活作用；
    ④具有廣泛的中毒效應(yīng)；
    ⑤結(jié)構(gòu)特異性：分子結(jié)構(gòu)不同，毒性差異很大。例如黃曲霉毒素B1是毒性最強(qiáng)的真菌毒素，比砒霜毒性還強(qiáng)，但是僅改變其分子結(jié)構(gòu)中的一個(gè)化學(xué)鍵，它的毒性就會(huì)顯著下降。其實(shí)還有一個(gè)特點(diǎn)需要特別強(qiáng)調(diào)，就是真菌毒素在樣品中的分布是不均勻的，因此分析過(guò)程中的取樣方式和取樣量非常重要，往往能夠決定結(jié)果誤差的范圍。
    目前，己確定的真菌毒素有400多種，常見(jiàn)毒素包括：黃曲霉毒素（AF，包括B1、B2、M1、M2）、玉米赤霉烯酮/醇（ZEN）、赭曲毒素（OTA）、T2毒素、嘔吐毒素（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，DON）、伏馬毒素（FM，包括B1、B2、B3）等。其中黃曲霉毒素B1被認(rèn)為是毒性最強(qiáng)的真菌毒素，也是糧食和飼料監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)。

    真菌毒素的危害

    據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，每年全世界大約有25%的農(nóng)產(chǎn)品受到真菌毒素污染，其中約2%因污染失去價(jià)值，引起的損失達(dá)千億美元。飼料及原料（糧食）中的真菌毒素污染對(duì)畜牧業(yè)影響巨大，美國(guó)因真菌毒素造成的損失達(dá)到14.4億美元/年，我國(guó)損失則更大，達(dá)到150億美元/年。由真菌毒素污染導(dǎo)致的食品質(zhì)量安全問(wèn)題已經(jīng)引發(fā)社會(huì)的廣泛關(guān)注，真菌毒素是導(dǎo)致糧食和飼料污染的重要原因，如果動(dòng)物食用了被真菌毒素污染的飼料，也可能造成動(dòng)物源性食品的污染。例如，奶牛吃了被黃曲霉毒素B1污染的飼料，它所產(chǎn)的牛奶中就會(huì)含有黃曲霉毒素M1。不僅如此，被黃曲霉毒素污染的飼料還會(huì)影響食用動(dòng)物的健康。仍以奶牛為例，真菌毒素通過(guò)改變機(jī)體的新陳代謝和行為，導(dǎo)致奶牛產(chǎn)奶量降低，因飼喂受真菌毒素污染的飼料而造成產(chǎn)奶量減少是奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)的常見(jiàn)現(xiàn)象。對(duì)奶牛產(chǎn)奶造成不利影響的真菌毒素主要是黃曲霉毒素和不同種類(lèi)的鐮刀菌毒素。黃曲霉毒素?fù)p害奶牛的肝臟組織，破壞肝臟功能，嚴(yán)重情況下會(huì)導(dǎo)致奶牛死亡。除此之外，黃曲霉毒素對(duì)豬的胚胎致死率高，致畸性強(qiáng)，易導(dǎo)致胚胎早期死亡被吸收、流產(chǎn)、弱仔，從而降低繁殖率。
    概括來(lái)說(shuō)，真菌毒素的危害性主要具有以下特點(diǎn)：其一為普遍性，即在谷物生產(chǎn)、儲(chǔ)藏、加工階段已經(jīng)被感染，尤以玉米更為嚴(yán)重。二是隱蔽性—感官難以判斷，除非已經(jīng)發(fā)生顏色、氣味等變化，隱蔽性毒素?zé)o法用常規(guī)物理方法判斷。第三為微量性：低劑量即可導(dǎo)致畜禽或人患病。第四，蓄積性：一些真菌毒素如玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素等不易排出體外，會(huì)在體內(nèi)蓄積達(dá)到中毒劑量。最后是協(xié)同性，表現(xiàn)為混合污染，協(xié)同作用，加大對(duì)人類(lèi)、畜禽機(jī)體和生產(chǎn)性能的危害。
    為了消除真菌毒素的危害，目前人們主要從兩個(gè)方面著手：一是建立準(zhǔn)確、快速、靈敏、多目標(biāo)物的檢測(cè)技術(shù)；二是研究發(fā)現(xiàn)真菌毒素的脫毒技術(shù)的研究。

    國(guó)內(nèi)市場(chǎng)真菌毒素快檢產(chǎn)品現(xiàn)狀

    從“十五”起，食品質(zhì)量安全問(wèn)題就已引起了國(guó)家政府的高度重視，政府的重要工作會(huì)議都強(qiáng)調(diào)了食品質(zhì)量安全的重要性。2015年10月1日實(shí)施的新《食品安全法》，加大了對(duì)食品質(zhì)量安全的監(jiān)管力度和懲治力度。同時(shí)，新《食品安全法》第一百一十二條規(guī)定：縣級(jí)以上人民政府食品藥品監(jiān)督管理部門(mén)在食品安全監(jiān)督管理工作中可以采用國(guó)家規(guī)定的快速檢測(cè)方法對(duì)食品進(jìn)行抽查檢測(cè)。對(duì)抽查檢測(cè)結(jié)果表明可能不符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)的食品，應(yīng)當(dāng)依照本法第八十七條的規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)。抽查檢測(cè)結(jié)果確定有關(guān)食品不符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)的，可以作為行政處罰的依據(jù)。以上，從法律層面肯定了快檢可以作為一種執(zhí)法手段，這也就對(duì)快檢技術(shù)及產(chǎn)品提出了更高的要求。
    經(jīng)過(guò)我國(guó)政府十余年的努力，國(guó)產(chǎn)食品中的化學(xué)污染和殘留已經(jīng)得到有效控制，但是真菌毒素污染問(wèn)題仍較為突出。真菌毒素對(duì)糧食、飼料、奶、肉、蔬菜、水果的危害已經(jīng)到達(dá)令人觸目驚心的程度，對(duì)真菌毒素的監(jiān)測(cè)也已經(jīng)引起國(guó)家相關(guān)部門(mén)的充分重視。在國(guó)家糧食局、農(nóng)業(yè)部、國(guó)家食藥總局等部門(mén)的監(jiān)控計(jì)劃中，都把食品中真菌毒素列為監(jiān)測(cè)重點(diǎn)。2017年3月17日，國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局發(fā)布的《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素的限量》（GB 2761-2017）替代了GB 2761-2011。科技部“十三五”國(guó)家科技支撐項(xiàng)目也把真菌毒素檢測(cè)及脫毒技術(shù)列為資助重點(diǎn)，為控制真菌毒素的社會(huì)危害提供技術(shù)保障。
    目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)真菌毒素的免疫快檢方法主要包括膠體金檢測(cè)卡、酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒和時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)卡等，相關(guān)的快檢儀器設(shè)備有酶標(biāo)儀、膠體金讀卡儀和時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀。此外，還包括一些前處理方法和設(shè)備，如凈化柱、免疫親和柱等。國(guó)內(nèi)有上百家食品安全快檢公司能生產(chǎn)檢測(cè)真菌毒素的快檢產(chǎn)品，但產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，高質(zhì)量的產(chǎn)品相對(duì)較少，造成的現(xiàn)實(shí)情況是真菌毒素快檢產(chǎn)品在我國(guó)市場(chǎng)還無(wú)法完全實(shí)現(xiàn)本土化。一些權(quán)威檢測(cè)和監(jiān)管部門(mén)依然比較認(rèn)同美國(guó)羅馬（Romer）公司和Charm公司的產(chǎn)品。一個(gè)普遍的觀點(diǎn)是，雖然國(guó)外產(chǎn)品價(jià)格比國(guó)內(nèi)產(chǎn)品高50%甚至100%，但是其產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、準(zhǔn)確度高。事實(shí)上，國(guó)內(nèi)自主研發(fā)的產(chǎn)品在質(zhì)量上已經(jīng)有所突破，在一些官方組織的產(chǎn)品比對(duì)實(shí)驗(yàn)中，甚至出現(xiàn)國(guó)產(chǎn)產(chǎn)品質(zhì)量超過(guò)國(guó)外產(chǎn)品的情況，這可以說(shuō)是國(guó)內(nèi)真菌毒素快檢行業(yè)的一大進(jìn)步。但大的技術(shù)方向還是步國(guó)外技術(shù)的后塵，依然是模仿+超越的模式。其實(shí)從樣本適用性和價(jià)格的角度講，國(guó)內(nèi)產(chǎn)品應(yīng)該具有明顯的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。這就需要國(guó)內(nèi)的企業(yè)在質(zhì)量上把關(guān)，提高核心技術(shù)優(yōu)勢(shì)，對(duì)真菌毒素的性質(zhì)、危害及在糧食及飼料中的代謝動(dòng)力學(xué)有充分了解，提早在產(chǎn)品研發(fā)上攻關(guān)，盡早完成市場(chǎng)培育，推動(dòng)企業(yè)的核心競(jìng)爭(zhēng)力，實(shí)現(xiàn)我國(guó)自主研發(fā)的產(chǎn)品對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的覆蓋，從而保障我國(guó)人民群眾的生命財(cái)產(chǎn)安全，實(shí)現(xiàn)對(duì)糧食、飼料、奶、肉及水果、蔬菜的有效監(jiān)管，維護(hù)我國(guó)對(duì)外貿(mào)易活動(dòng)的正常進(jìn)行。

    真菌毒素免疫檢測(cè)的關(guān)鍵技術(shù)點(diǎn)

    技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)
    目前，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)真菌毒素快檢產(chǎn)品主要是基于抗原、抗體（不排除使用受體和配體）特異性反應(yīng)的免疫快檢產(chǎn)品。產(chǎn)品研發(fā)中的重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題主要集中在原材料的質(zhì)量、產(chǎn)品的適用性、產(chǎn)品的性能、重點(diǎn)監(jiān)測(cè)物這4個(gè)方面。
    第一，抗原、抗體等原材料的質(zhì)量。要了解原材料的重要性，需先了解抗體制備流程。真菌毒素屬于小分子物質(zhì)（分子量＜1000），其本身不具有免疫原性，需要與大蛋白偶聯(lián)才能對(duì)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。如何將小分子的物質(zhì)轉(zhuǎn)變成免疫原？首先需要合成一個(gè)帶有活性基團(tuán)（一般是-COOH和-NH2）的碳鏈長(zhǎng)臂，即半抗原。半抗原位點(diǎn)的選擇與抗體的特異性關(guān)系極大，其與大的蛋白結(jié)合（比如牛血清白蛋白BSA、卵清蛋白OVA等）可獲得免疫原和包被原。用免疫原免疫動(dòng)物待效價(jià)和特異性達(dá)到要求，取動(dòng)物抗血清獲得多克隆抗體，如果不采血而是進(jìn)一步取動(dòng)物脾臟細(xì)胞、融合、克隆、培養(yǎng)上清和打腹水等步驟，將獲得單克隆抗體。免疫動(dòng)物的類(lèi)型和免疫方法與抗體的親和力關(guān)系較大，抗體的親和性是抗體質(zhì)量的一個(gè)重要參數(shù)。本項(xiàng)目研究中包括但不限于以下3點(diǎn)要特別關(guān)注—半抗原偶聯(lián)的位點(diǎn)、免疫方式、單抗制備過(guò)程中的克隆和篩選。
    在真菌毒素抗體制備方面，國(guó)內(nèi)一些高校、科研機(jī)構(gòu)及規(guī)模較大的食品安全檢測(cè)試劑公司都在開(kāi)展相關(guān)工作，其中不乏一些高特異性（或廣譜性）、高親和性的抗體。而且一些技術(shù)申請(qǐng)了國(guó)內(nèi)專(zhuān)利，甚至有些科研機(jī)構(gòu)抗體的制備方法還申請(qǐng)了國(guó)外專(zhuān)利，并把抗體賣(mài)到了國(guó)外多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。好的原料來(lái)源是優(yōu)質(zhì)快檢產(chǎn)品的充分必要條件，而高質(zhì)量、穩(wěn)定來(lái)源的抗原抗體是目前快檢產(chǎn)品研發(fā)公司面臨的最主要問(wèn)題之一�？贵w的特異性與匹配的抗原關(guān)系極大，穩(wěn)定的抗原制備流程也是必須關(guān)注的重點(diǎn)。
    第二，快檢產(chǎn)品的適用性。國(guó)內(nèi)真菌毒素快檢產(chǎn)品沒(méi)有覆蓋國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的原因是產(chǎn)品質(zhì)量不能完全滿足檢測(cè)要求，或者說(shuō)國(guó)外的產(chǎn)品能更好地滿足檢測(cè)要求（準(zhǔn)確性、便捷性）。比如Charm的膠體金檢測(cè)卡，一條C線，兩條T線，能夠通過(guò)讀卡儀實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。而國(guó)內(nèi)膠體金檢查卡，基本以定性檢測(cè)為主，只有極少數(shù)廠家推出了膠體金定量檢測(cè)產(chǎn)品，并將檢測(cè)結(jié)果數(shù)據(jù)化，與食品安全的大數(shù)據(jù)管理相符合。包括北京智云達(dá)科技股份有限公司在內(nèi)的少數(shù)公司選擇了從另一個(gè)技術(shù)角度解決檢測(cè)卡的定量問(wèn)題，即時(shí)間分辨熒光檢測(cè)技術(shù)。時(shí)間分辨熒光檢測(cè)卡，檢測(cè)的激發(fā)光在300~400nm之間，而發(fā)射光在600~650nm之間，受外部干擾少，所以穩(wěn)定性較好，可更高效的實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。此外，熒光信號(hào)比膠體金的可見(jiàn)光信號(hào)更強(qiáng)，提高了檢測(cè)技術(shù)的靈敏度，進(jìn)而簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程。
    第三，產(chǎn)品的性能。在保證靈敏度的前提下，產(chǎn)品的性能涉及到兩方面內(nèi)容，即檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。在產(chǎn)品研發(fā)過(guò)程中，有幾個(gè)節(jié)點(diǎn)非常重要：第一節(jié)點(diǎn)是樣本的選擇，即樣本的適用性。檢測(cè)樣本是產(chǎn)品研發(fā)過(guò)程中必然要進(jìn)行的一個(gè)過(guò)程，而且產(chǎn)品的最終驗(yàn)證也要落實(shí)到樣本檢測(cè)上。首先，要有通過(guò)國(guó)標(biāo)方法確定陰性和陽(yáng)性的樣本。一些快檢試劑研發(fā)公司為了壓縮研發(fā)時(shí)間，對(duì)于樣本不愿意進(jìn)行足夠的投入，把從超市買(mǎi)來(lái)的樣本默認(rèn)為陰性樣本，姑且不說(shuō)超市的樣本是否真的是陰性樣本，連樣本在存儲(chǔ)過(guò)程中真菌毒素的變化情況都有待確證。第二節(jié)點(diǎn)是檢測(cè)體系的穩(wěn)定性。國(guó)外真菌毒素快檢產(chǎn)品的穩(wěn)定性優(yōu)于國(guó)內(nèi)產(chǎn)品，包括檢測(cè)結(jié)果的穩(wěn)定性和有效保存期內(nèi)的穩(wěn)定性。批間差是現(xiàn)有國(guó)內(nèi)免疫產(chǎn)品尤其是真菌毒素膠體金檢測(cè)卡的主要瓶頸，這是產(chǎn)品性能方面關(guān)注的第二個(gè)重要方面。