多肽合成方法及難題解決
多肽合成方法是把不同的或相同的多個氨基酸按指定順序連結起來構成肽鏈(含多個肽鍵-CONH-)化合物的合成方法。由德國化學家費舍爾(E.Fischer)所首創(chuàng)。
進行多肽合成，必須首先解決兩個問題：
1.要將氨基酸兩個官能團中的一個(通常選氨基)封閉，即用保護基團保護起來，只讓沒被保護的那個基團(羧基)去同另一個氨基酸分子反應。采用的保護基團不僅要易于同被保護基團發(fā)生反應，還須在肽鍵形成后易去除。
2.要活化沒被封閉的官能團，使之能在較溫和的條件下發(fā)生反應。可作為氨基保護試劑的有氯甲酸芐酯和叔丁氧甲酰氯等，用來活化羧基的方法則是將羧基變成酰氯、酯、混合酸酐等衍生物或加縮合劑(失水劑)二環(huán)已基碳酰二亞胺，使氨基和羧基結合起來。
1962年梅瑞費爾德(R.Merrifield)引入了一個新的多肽合成方法——固相多肽合成法。其原理是讓第一個氨基酸附在一種不溶性高聚物分子上，然后再逐一同別的氨基酸連結，增長的肽鏈連結在不溶性高聚物上，這樣可大大地減少每次分離操作的損失，簡化提純手續(xù)，省去純化個別中間體的麻煩。并能使加料處理機械化和自動化，縮短了多肽合成周期。當完成多肽連接后，用還原性斷裂法把多肽同高聚物分離，再用色層法提純。固相法的建立和應用大大地促進了多肽合成研究。
多肽合成方法分類
多肽的合成主要分為兩條途徑:化學合成多肽和生物合成多肽。
化學合成主要是以氨基酸與氨基酸之間縮合的形式來進行。在合成含有特定順序的多肽時，由于多肽合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體，多肽合成時應將不需要反應的基團暫時保護起來，方可進行成肽反應，這樣保證了多肽合成目標產物的定向性。多肽的化學合成又分為液相合成和固相合成。
多肽液相合成主要分為逐步合成和片段組合兩種策略。逐步合成簡潔迅速，可用于各種生物活性多肽片段的合成。片段組合法主要包括天然化學連接和施陶丁格連接。近年，多肽液相片段合成法發(fā)展迅速，在多肽和蛋白質合成領域已取得了重大突破。在多肽片段合成法中，根據多肽片段的化學特定性或化學選擇性，多肽片段能夠自發(fā)進行連接，得到目標多肽。因為多肽片段含有的氨基酸殘基相對較少，所以純度較高，且易于純化。
1963年，美國著名生物化學家Merrifield提出了固相合成法，開展了多肽固相合成，即將氨基酸的C末端(羧基端)連接在不溶樹脂上，然后在此樹脂上依次進行氨基酸的縮合、延長肽鏈。固相合成方法可分為叔丁氧羰基(Boc)方法和9-芴甲基氧羰基(Fmoc)方法。人們以多肽的液相和固相合成方法為基礎又發(fā)展了氨基酸的羧內酸酐(NCA)法、組合化學法等。
多肽的生物合成方法主要包括發(fā)酵法、酶解法，隨著生物工程技術的發(fā)展，以DNA重組技術為主導的基因工程法也被應用于多肽的合成。
其他多肽合成方法
1、氨基酸的羧內酸酐法(NCA)
氨基酸的羧內酸酐的氨基保護基也可活化羧基。
NCA的原理:在堿性條件下，氨基酸陰離子與NCA形成一個更穩(wěn)定的氨基甲酸酯類離子，在酸化時該離子失去二氧化碳，生成二肽。生成的二肽又與其他的NCA結合，反復進行。
NCA適用于短鏈肽片段的多肽合成，其周期短、操作簡單、成本低、得到產物分子量高，在目前多肽合成中所占比例較大，技術也較為通用。
2、組合化學法
20世紀80年代，以固相多肽合成為基礎提出了組合化學法，即氨基酸的構建單元通過組合的方式進行連接，合成出含有大量化合物的化學庫，并從中篩選出具有某種理化性質或藥理活性化合物的一套多肽合成策略和篩選方案。
組合化學法的多肽合成策略主要包括:混合-均分法、迭代法、光控定位組合庫法、茶葉袋法等。組合化學法的最大優(yōu)點在于可同時合成多種化合物，并且能最大限度地篩選各種新化合物及其異構體。
3、酶解法
酶解法是用生物酶降解植物蛋白質和動物蛋白質，獲得小分子多肽。酶解法因其多肽產量低、投資大、周期長、污染嚴重，未能實現(xiàn)工業(yè)化生產。酶解法獲得的多肽能夠保留蛋白質原有的營養(yǎng)價值，并且可以獲得比原蛋白質更多的功能，更加綠色，更加健康。
4、基因工程法
基因工程法主要以DNA重組技術為基礎，通過合適的DNA模板來控制多肽的序列合成。有研究者通過基因工程法獲得了準彈性蛋白-聚纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈氨酸-甘氨酸肽(VPGVG)。
利用基因工程技術生產的活性多肽還有肽類抗生素、干擾素類、白介素類、生長因子類、腫瘤壞死因子、人生長激素，血液中凝血因子、促紅細胞生成素，組織非蛋白纖溶酶原等。
基因工程法合成多肽具有表達定向性強，安全衛(wèi)生，原料來源廣泛和成本低等優(yōu)點，但因存在高效表達，不易分離，產率低的問題，難以實現(xiàn)規(guī)�；a。
5、發(fā)酵法
發(fā)酵法是從微生物代謝產物中獲得多肽的方法。雖然發(fā)酵法的成本低，但其應用范圍較窄，因為現(xiàn)在微生物能夠獨立合成的聚氨基酸只有ε-聚賴氨酸(ε-PL)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和藍細菌肽。
進行多肽合成，必須首先解決兩個問題：
1.要將氨基酸兩個官能團中的一個(通常選氨基)封閉，即用保護基團保護起來，只讓沒被保護的那個基團(羧基)去同另一個氨基酸分子反應。采用的保護基團不僅要易于同被保護基團發(fā)生反應，還須在肽鍵形成后易去除。
2.要活化沒被封閉的官能團，使之能在較溫和的條件下發(fā)生反應。可作為氨基保護試劑的有氯甲酸芐酯和叔丁氧甲酰氯等，用來活化羧基的方法則是將羧基變成酰氯、酯、混合酸酐等衍生物或加縮合劑(失水劑)二環(huán)已基碳酰二亞胺，使氨基和羧基結合起來。
1962年梅瑞費爾德(R.Merrifield)引入了一個新的多肽合成方法——固相多肽合成法。其原理是讓第一個氨基酸附在一種不溶性高聚物分子上，然后再逐一同別的氨基酸連結，增長的肽鏈連結在不溶性高聚物上，這樣可大大地減少每次分離操作的損失，簡化提純手續(xù)，省去純化個別中間體的麻煩。并能使加料處理機械化和自動化，縮短了多肽合成周期。當完成多肽連接后，用還原性斷裂法把多肽同高聚物分離，再用色層法提純。固相法的建立和應用大大地促進了多肽合成研究。
多肽的合成主要分為兩條途徑:化學合成多肽和生物合成多肽。
化學合成主要是以氨基酸與氨基酸之間縮合的形式來進行。在合成含有特定順序的多肽時，由于多肽合成原料中含有官能度大于2的氨基酸單體，多肽合成時應將不需要反應的基團暫時保護起來，方可進行成肽反應，這樣保證了多肽合成目標產物的定向性。多肽的化學合成又分為液相合成和固相合成。
多肽液相合成主要分為逐步合成和片段組合兩種策略。逐步合成簡潔迅速，可用于各種生物活性多肽片段的合成。片段組合法主要包括天然化學連接和施陶丁格連接。近年，多肽液相片段合成法發(fā)展迅速，在多肽和蛋白質合成領域已取得了重大突破。在多肽片段合成法中，根據多肽片段的化學特定性或化學選擇性，多肽片段能夠自發(fā)進行連接，得到目標多肽。因為多肽片段含有的氨基酸殘基相對較少，所以純度較高，且易于純化。
1963年，美國著名生物化學家Merrifield提出了固相合成法，開展了多肽固相合成，即將氨基酸的C末端(羧基端)連接在不溶樹脂上，然后在此樹脂上依次進行氨基酸的縮合、延長肽鏈。固相合成方法可分為叔丁氧羰基(Boc)方法和9-芴甲基氧羰基(Fmoc)方法。人們以多肽的液相和固相合成方法為基礎又發(fā)展了氨基酸的羧內酸酐(NCA)法、組合化學法等。
多肽的生物合成方法主要包括發(fā)酵法、酶解法，隨著生物工程技術的發(fā)展，以DNA重組技術為主導的基因工程法也被應用于多肽的合成。
1、氨基酸的羧內酸酐法(NCA)
氨基酸的羧內酸酐的氨基保護基也可活化羧基。
NCA的原理:在堿性條件下，氨基酸陰離子與NCA形成一個更穩(wěn)定的氨基甲酸酯類離子，在酸化時該離子失去二氧化碳，生成二肽。生成的二肽又與其他的NCA結合，反復進行。
NCA適用于短鏈肽片段的多肽合成，其周期短、操作簡單、成本低、得到產物分子量高，在目前多肽合成中所占比例較大，技術也較為通用。
2、組合化學法
20世紀80年代，以固相多肽合成為基礎提出了組合化學法，即氨基酸的構建單元通過組合的方式進行連接，合成出含有大量化合物的化學庫，并從中篩選出具有某種理化性質或藥理活性化合物的一套多肽合成策略和篩選方案。
組合化學法的多肽合成策略主要包括:混合-均分法、迭代法、光控定位組合庫法、茶葉袋法等。組合化學法的最大優(yōu)點在于可同時合成多種化合物，并且能最大限度地篩選各種新化合物及其異構體。
3、酶解法
酶解法是用生物酶降解植物蛋白質和動物蛋白質，獲得小分子多肽。酶解法因其多肽產量低、投資大、周期長、污染嚴重，未能實現(xiàn)工業(yè)化生產。酶解法獲得的多肽能夠保留蛋白質原有的營養(yǎng)價值，并且可以獲得比原蛋白質更多的功能，更加綠色，更加健康。
4、基因工程法
基因工程法主要以DNA重組技術為基礎，通過合適的DNA模板來控制多肽的序列合成。有研究者通過基因工程法獲得了準彈性蛋白-聚纈氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈氨酸-甘氨酸肽(VPGVG)。
利用基因工程技術生產的活性多肽還有肽類抗生素、干擾素類、白介素類、生長因子類、腫瘤壞死因子、人生長激素，血液中凝血因子、促紅細胞生成素，組織非蛋白纖溶酶原等。
基因工程法合成多肽具有表達定向性強，安全衛(wèi)生，原料來源廣泛和成本低等優(yōu)點，但因存在高效表達，不易分離，產率低的問題，難以實現(xiàn)規(guī)�；a。
5、發(fā)酵法
發(fā)酵法是從微生物代謝產物中獲得多肽的方法。雖然發(fā)酵法的成本低，但其應用范圍較窄，因為現(xiàn)在微生物能夠獨立合成的聚氨基酸只有ε-聚賴氨酸(ε-PL)、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)和藍細菌肽。
