DNA測序方法中自動測序法的操作步驟

DNA測序方法中自動測序法的操作步驟
基因分析儀(即DNA測序儀)，采用毛細管電泳技術(shù)取代傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺平板電泳，應(yīng)用該公司專利的四色熒光染料標(biāo)記的ddNTP(標(biāo)記終止物法)，因此通過單引物PCR測序反應(yīng)，生成的PCR產(chǎn)物則是相差1個堿基的3'末端為4種不同熒光染料的單鏈DNA混合物，使得四種熒光染料的測序PCR產(chǎn)物可在一根毛細管內(nèi)電泳，從而避免了泳道間遷移率差異的影響，大大提高了測序的精確度。由于分子大小不同，在毛細管電泳中的遷移率也不同，當(dāng)其通過毛細管讀數(shù)窗口段時，激光檢測器窗口中的CCD(charge-coupled device)攝影機檢測器就可對熒光分子逐個進行檢測，激發(fā)的熒光經(jīng)光柵分光，以區(qū)分代表不同堿基信息的不同顏色的熒光，并在CCD攝影機上同步成像，分析軟件可自動將不同熒光轉(zhuǎn)變?yōu)镈NA序列，從而達到DNA測序的目的。分析結(jié)果能以凝膠電泳圖譜、熒光吸收峰圖或堿基排列順序等多種形式輸出。
它是一臺能自動灌膠、自動進樣、自動數(shù)據(jù)收集分析等全自動電腦控制的測定DNA片段的堿基順序或大小和定量的高檔精密儀器。PE公司還提供凝膠高分子聚合物，包括DNA測序膠(POP 6)和GeneScan膠(POP 4)。這些凝膠顆粒孔徑均一，避免了配膠條件不一致對測序精度的影響。它主要由毛細管電泳裝置、Macintosh電腦、彩色打印機和電泳等附件組成。電腦中則包括資料收集，分析和儀器運行等軟件。它使用最新的CCD攝影機檢測器，使DNA測序縮短至2.5h，PCR片段大小分析和定量分析為10～40min。
由于該儀器具有DNA測序，PCR片段大小分析和定量分析等功能，因此可進行DNA測序、雜合子分析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)、微衛(wèi)星序列分析、長片段PCR、RT-PCR(定量PCR)等分析，臨床上可除進行常規(guī)DNA測序外，還可進行單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、基因突變檢測、HLA配型、法醫(yī)學(xué)上的親子和個體鑒定、微生物與病毒的分型與鑒定等。
一、準(zhǔn)備工作
1. BigDye測序反應(yīng)試劑盒 主要試劑是BigDye Mix，內(nèi)含PE專利四色熒光標(biāo)記的ddNTP和普通dNTP，AmpliTaq DNA polymerase FS，反應(yīng)緩沖液等。
2. pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA對照模板 0.2 g/L，試劑盒配套試劑。
3. M13(-21)引物 TGTAAAACGACGGCCAGT，3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl，試劑盒配套試劑。
4. DNA測序模板 可以是PCR產(chǎn)物、單鏈DNA和質(zhì)粒DNA等。模板濃度應(yīng)調(diào)整在PCR反應(yīng)時取量1 μl為宜。本實驗測定的質(zhì)粒DNA，濃度為0.2 g/L，即200 ng/μl。
5. 引物需根據(jù)所要測定的DNA片段設(shè)計正向或反向引物，配制成3.2 μmol/L，即3.2 pmol/μl。如重組質(zhì)粒中含通用引物序列也可用通用引物，如M13(-21)引物，T7引物等。
6. 滅菌去離子水或三蒸水。
7. 0.2 ml或和0.5 ml的PCR管 蓋體分離。
8. 3 mol/L 醋酸鈉(pH5.2) 稱取40.8 g NaAc·3H2O溶于70 ml蒸餾水中，冰醋酸調(diào)pH至5.2，定容至100 ml，高壓滅菌后分裝。
9. 70%乙醇和無水乙醇。
10. NaAc/乙醇混合液 取37.5 ml無水乙醇和2.5 ml 3 mol/L NaAc混勻，室溫可保存1年。
11. POP 6測序膠 。
12. 模板抑制試劑(TSR) 。
13. 10×電泳緩沖液 。
14. 全自動DNA測序儀。
15. PCR儀。
16. 臺式冷凍高速離心機。
17. 臺式高速離心機或袖珍離心機。
二、PCR測序反應(yīng)
1. 取0.2 ml的PCR管，用記號筆編號，將管插在顆粒冰中，按下表加試劑：
所加試劑 測定模板管 標(biāo)準(zhǔn)對照管
BigDye Mix 1 μl 1 μl
待測的質(zhì)粒DNA 1 μl －
pGEM-3Zf (+) 雙鏈DNA － 1 μl
待測DNA的正向引物 1 μl －
M13(-21)引物 － 1 μl
滅菌去離子水 2 μl 2 μl
總反應(yīng)體積5 μl，不加輕礦物油或石蠟油，蓋緊PCR管，用手指彈管混勻，稍離心。
2. 將PCR管置于9600或2400型PCR儀上進行擴增。98℃變性2 min后進行PCR循環(huán)，PCR循環(huán)參數(shù)為96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃4 min，25個循環(huán)，擴增結(jié)束后設(shè)置4℃保溫。
三、醋酸鈉/乙醇法純化PCR產(chǎn)物
1. 將混合物離心，將擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5 ml EP管中。
2. 加入25 μl醋酸鈉/乙醇混合液，充分振蕩，置冰上10 min以沉淀DNA。12 000 r/min于4℃離心30 min，小心棄上清。
3. 加70%(V/V)的乙醇50 μl洗滌沉淀2次。12 000 r/min于4℃離心5 min，小心棄上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10～15 min。
四、電泳前測序PCR產(chǎn)物的處理
1. 加入12 μl的TSR于離心管中，劇烈振蕩，讓其充分溶解DNA沉淀，稍離心。
2. 將溶液轉(zhuǎn)移至蓋體分離的0.2 ml PCR管中，稍離心。
3. 在PCR儀上進行熱變性(95℃ 2 min)，冰中驟冷，待上機。
五、上機操作
1. 按儀器操作說明書安裝毛細管，進行毛細管位置的校正，人工手動灌膠和建立運行的測序順序文件。
2. 儀器將自動灌膠至毛細管，1.2 kV預(yù)電泳5 min，按編程次序自動進樣，再預(yù)電泳(1.2 kV，20 min)，在7.5 kV下電泳2 h。
3. 電泳結(jié)束后儀器會自動清洗，灌膠，進下一樣品，預(yù)電泳和電泳。
4. 每一個樣品電泳總時間為2.5 h。
5. 電泳結(jié)束后儀器會自動分析或打印出彩色測序圖譜。
六、序列分析
儀器將自動進行序列分析，并可根據(jù)用戶要求進行序列比較。如測序序列已知，可通過序列比較以星號標(biāo)出差異堿基處，提高工作效率。
七、儀器清洗
測序完畢按儀器操作規(guī)程進行儀器清洗與保養(yǎng)。
八、計算
1. 測序反應(yīng)精確度計算公式：100%－差異堿基數(shù)(不包括N數(shù))/650×100%。
2. 差異堿基即測定的DNA序列與已知標(biāo)準(zhǔn)DNA序列比較不同的堿基，N為儀器不能辨讀的堿基。
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