ACE C18-PFP色譜柱介紹Ⅱ- 改善分離度

具有獨(dú)特選擇性的C18 鍵合相：
1.有保證的可重現(xiàn)性
2.極佳的鍵合相穩(wěn)定性
3.疏水和五氟苯基“混合模式”的相互作用

 

改善色譜分離度
色譜分離的目標(biāo)是在最短的時(shí)間內(nèi)獲得目標(biāo)組分的足夠分離度（Rs）。

1.5的分離度可以實(shí)現(xiàn)基線分離，然而對(duì)于可以在實(shí)驗(yàn)室之間易于轉(zhuǎn)換的耐用、可重復(fù)方法而言，理想的分離度是1.8-2.0。
分離度方程告訴我們什么變量可以影響分離度：

Rs = 目標(biāo)峰之間的分離度 N = 柱效- 由理論塔板數(shù)測(cè)定 α= 選擇性- 兩峰的保留值比率（k值） k =保留因子- 洗脫峰所需的柱體積數(shù)

增加分離度Rs可以通過(guò)增加N、α或k來(lái)實(shí)現(xiàn)。

然而，如圖1所示，可以看出，增加N或k以改善Rs的回報(bào)率快速下降。

例如，Rs僅隨著N平方根的增加而增加。

可以通過(guò)增加柱長(zhǎng)或降低柱填充材料的粒徑或兩者的某種組合來(lái)增加N。

 

無(wú)論哪種方式，系統(tǒng)背壓隨著N的增加而增加，因此通過(guò)增加N實(shí)現(xiàn)令人滿意的分離，其“成本”可能是極高的壓力。
同樣，增加保留值（k值）將會(huì)增加Rs，但回報(bào)率也快速下降。

將k增加至超過(guò)10通常是Rs與分析時(shí)間之間的不利權(quán)衡，因?yàn)橹挥蠷s的邊際收益隨著保留時(shí)間的增加而實(shí)現(xiàn)。

該效應(yīng)的圖形表示參見(jiàn)下述圖1。

圖1 N、α和k對(duì)分離度(Rs)的影響
對(duì)于典型的分離，其中：N = 10,000, k = 4, α= 1.1

增加N、α或k可以提高分離度(Rs)。

然而，從這些圖中可以看出，N或k的提高都會(huì)迅速降低回報(bào)率。
另一方面，提高選擇性（α）則沒(méi)有這個(gè)問(wèn)題，因此其成為開發(fā)分離方法時(shí)的最佳優(yōu)化變量。

 

增加α可以增加Rs，但不同于N和k,不會(huì)受回報(bào)率下降的約束。

α的變化對(duì)壓力沒(méi)有影響，對(duì)分離時(shí)間的影響也是微乎其微的（參見(jiàn)圖2）。

因此，在開發(fā)分離方法時(shí)，α是最重要的變數(shù)。

優(yōu)化α可以使您在所有目標(biāo)峰之間達(dá)到滿意的分離度，同時(shí)保持系統(tǒng)背壓和分離時(shí)間在可接受范圍內(nèi)。

 

改善色譜分離度- 選擇性或柱效？
選擇性(α)由流動(dòng)相、溫度和固定相化學(xué)物質(zhì)控制。大多數(shù)方法開發(fā)策略將探索所有這些色譜變量。
如果使用“標(biāo)準(zhǔn)”3μm C18相沒(méi)有達(dá)到足夠的分離度，推薦優(yōu)化分離的色譜選擇性而不是分離柱效，如下述實(shí)例所示。
通過(guò)簡(jiǎn)單地將固定相化學(xué)物質(zhì)（即色譜柱）改變?yōu)榫哂刑娲�色譜選擇性的固定相化學(xué)物質(zhì)，易于在標(biāo)準(zhǔn)HPLC系統(tǒng)上獲得所需分離度，而無(wú)需昂貴的UHPLC儀器。

另外，也可以避免復(fù)雜的流動(dòng)相組分、升高的溫度和侵蝕性pH條件。

 

圖2利用選擇性實(shí)現(xiàn)快速、高分離度的分離

 

樣品：1）對(duì)乙酰氨基酚2）氫氯噻嗪3）甲基苯基亞砜4）甲基苯基砜5）阿司匹林6）非那西丁7）1,3-二硝基苯
8）1,2,4-三甲氧基苯9）苯甲酸乙酯10）尼美舒利11）布洛芬12）吲哚美辛13）甲芬那酸
色譜柱尺寸：50 x 2.1 mm 流速：0.60 ml/min 溫度：40°C 檢測(cè)：UV, 254 nm 流動(dòng)相：A = 5 mM甲酸（溶于水中）以及B = 5 mM（溶于甲醇中），梯度= 在5分鐘內(nèi)3-100% B
比較數(shù)據(jù)不代表所有應(yīng)用。

 

在保持C18鍵合相的同時(shí)，將粒徑從3μm減小至2μm以下，并不能顯著改善分離效果，另外也會(huì)導(dǎo)致壓力明顯增加。
ACE C18-PFP色譜柱為3個(gè)關(guān)鍵對(duì)提供了更佳的選擇性(α)，因此與2μm以下的C18色譜柱相比，其可以提供極佳的分離效果，即使2μm以下的色譜柱可以提供更高的柱效。
與使用具有高塔板數(shù)和高壓的色譜柱嘗試進(jìn)行峰分離所獲得的結(jié)果相比，利用選擇性的能力可以獲得更佳的分離效果。