HPLC故障排除2 - 保留時間問題

2.保留時間問題

 

可能致因	預(yù)防措施/解決方案
減少保留時間
鍵合固定相的損失 （流失）	更換柱 （更換色譜柱） 在pH值為2-8的硅基（硅膠基質(zhì)）RP柱上操作
固定相上的（存在）活性基團(tuán)	在流動相中使用有機(jī)改性劑 增加緩沖強(qiáng)度 （增加緩沖液離子強(qiáng)度）
增加流量 （流速）	檢查并調(diào)整泵的流量（流速）
柱超載 （色譜柱過載）	減少注入的樣本量 （減小進(jìn)樣量） 使用具有更大內(nèi)徑的柱 （色譜柱）
延長保留時間
改變流動相的成分	覆蓋溶劑容器（蓋緊溶劑瓶） 制備新的流動相
鍵合固定相的損失 （流失）	更換柱 （更換色譜柱）
減少流量 （流速）	檢查并調(diào)整泵的流量（流速） 檢查系統(tǒng)是否存在泄漏，包括泵的密封 （泵密封圈）
流動相中存在氣泡	檢查流量和壓力 對流動相脫氣（流動相脫氣）
波動保留時間
柱平衡（色譜柱平衡時間）不足	在運(yùn)行之間（在兩次進(jìn)樣之間用更長時間） 充分平衡柱 用濃縮樣品調(diào)整色譜柱
流動相成分的變化	檢查流動相的成分，必要時補(bǔ)充新的成分（新配流動相） 檢查比例閥的準(zhǔn)確度
緩沖能力不足	使用> 20mM的緩沖液濃度
波動柱的溫度 （柱溫波動）	穩(wěn)定的（穩(wěn)定）室溫 保持柱恒溫

2. 保留變量（時間變動）
如果所有峰（色譜峰）的保留時間均發(fā)生了變化，其致因很可能是如下因素發(fā)生了變化：流動相的組成、色譜柱的化學(xué)性質(zhì)、色譜柱的溫度或流速。
如果等度或梯度流動相在在線式混合中出現(xiàn)錯誤，也可能導(dǎo)致保留時間出現(xiàn)問題。
下面將簡要介紹這些問題來源（對上述每個原因都簡述如下）。


2.1.如果操作人員操作不當(dāng)，則會導(dǎo)致流動相組成的意外變化，例如使用在線式混合系統(tǒng)時，流動相混合物（系統(tǒng)）設(shè)置不正確；或替換新批次流動相時，未妥善制備新的流動相（新流動相配制不正確）。
在極少數(shù)情況下，會出現(xiàn)流動相組分選擇性損失的情況，例如蒸發(fā)。
當(dāng)流動相發(fā)生變化時，峰形（色譜峰）通常會向相同的方向移動，以縮短或延長保留時間（保留時間變長或變短）；而相對保留（選擇性因子，a）通常會發(fā)生變化。
檢查流動相組成錯誤的最佳方法是仔細(xì)檢查（復(fù)查）系統(tǒng)設(shè)置；如有必要，應(yīng)制備新的流動相。
方法文件應(yīng)包含特定流動相變化影響的相關(guān)信息。例如，有機(jī)溶劑或pH值的微小變化會對色譜圖產(chǎn)生特征（在色譜圖體現(xiàn)出特征性的）影響，如分辨率或保留的變化（分離度的變化或保留時間的漂移）。
如果您懷疑設(shè)備出現(xiàn)故障，請將色譜柱和流動相移至另一個HPLC系統(tǒng)，然后再次運(yùn)行。
如果問題依然存在，則問題在于流動相或色譜柱；如果問題不再出現(xiàn)，則可能與其他系統(tǒng)組件或參數(shù)相關(guān)。


2.2.色譜柱化學(xué)（化學(xué)性質(zhì)）變化會在色譜柱的整個生命周期內(nèi)出現(xiàn)，并且一般會在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)逐漸變化。柱老化一般伴隨著柱背壓的上升、保留時間的逐漸變化（漂移）（更長或更短）以及更多的峰拖尾。
更換新柱以確定是否是柱老化導(dǎo)致的問題（可確證色譜柱老化）。
500-2000次注射（進(jìn)樣）的柱壽命是較為理想的；在這一點(diǎn)上，柱成本相較于整體分析，是十分微小的，所以更換新柱的可行性較高（色譜柱在整個分析的成本中所占比例低，因而可以合理更換色譜柱）。
如果色譜柱的使用壽命過短，應(yīng)仔細(xì)檢查操作條件，以確保它們適用于該色譜柱。
圖5顯示了在極端操作條件下，色譜柱壽命較短的示例（縮短的壽命）。


2.3.色譜柱溫度變化會導(dǎo)致保留時間的變化：每1°C的溫度變化會引起1-3％的保留時間變化。如果不使用柱溫箱（即“室溫”條件），由于實(shí)驗室溫度的變化，溫度通常會在日間（和夜間）循環(huán)（周期性）變化。
雖然在室內(nèi)恒溫器的測量下，實(shí)驗室溫度顯示為恒定，但是HPLC系統(tǒng)的微觀（微）環(huán)境可能會發(fā)生顯著變化，尤其是當(dāng)供暖或空調(diào)通風(fēng)口直接吹向系統(tǒng)時，溫度變化極為明顯。
使用柱溫箱可以避免色譜柱出現(xiàn)這樣的溫度問題，且HPLC系統(tǒng)應(yīng)遠(yuǎn)離通風(fēng)口放置。


2.4.流量（流速）問題可能是因存在氣泡、泄漏或泵問題（故障）導(dǎo)致的。
氣泡問題應(yīng)和低壓（或脈動壓力）以及保留時間的增加相關(guān)（可能伴有柱壓過低或柱壓波動，且保留時間延長）。
對于雙頭泵，如果只有一個泵頭存在氣泡，則流量和壓力可能會發(fā)生脈動（跳動）。
應(yīng)對流動相進(jìn)行脫氣，然后打開放氣閥清空泵，并向泵中多次加入5-10mL的流動相，以正常流速流經(jīng)泵，從而排出氣泡（打開排氣閥以正常流速的幾倍泵入5-10ml流動相經(jīng)過泵，以排出氣泡）。
在某些情況下，可能需要使用低粘度的脫氣溶劑，如甲醇（MeOH）或乙腈（ACN）來清除泵中頑固的氣泡。
泄漏也會延長保留時間。配件（接頭）上的滴水配件或玻璃體內(nèi)的結(jié)晶沉淀都是泄漏的證據(jù)（查看接頭如有液滴或結(jié)晶析出，可證明有泄露）。
請?zhí)貏e注意色譜柱上游的配件（之前的接頭）。
自動進(jìn)樣器內(nèi)的配件和密封件（接頭和密封圈）可能難以檢測，可借助手電筒和小鏡子進(jìn)行檢查。
如果使用不銹鋼配件，通常1/4的緊固螺母（將接頭螺好再擰緊1/4圈）便可以阻止泄漏。
使用PEEK配件（接頭）時，應(yīng)停止泵，松開接頭，將管子推到配件（接口）端口的底部，然后在重新啟動泵之前擰緊配件（接頭）。
擰緊PEEK配件（接頭）時如果存在流動的液體，會導(dǎo)致管道在配件中滑動，產(chǎn)生柱外死體積，進(jìn)而影響分離效果。
存在缺陷的止回閥（單向閥）或磨損的泵密封件（圈）會導(dǎo)致流量偏低或波動。
止回閥（單向閥）出現(xiàn)問題將導(dǎo)致壓力的波動。如果在清除泵中氣泡后還無法改善壓力波動的情況，則止回閥（單向閥）可能存在故障。
可以更換新的止回閥（單向閥）；也可以將止回閥（單向閥）放置在（裝有）MeOH的燒杯中，對其進(jìn)行超聲處理，以實(shí)現(xiàn)有效的清潔。
如果無法有效區(qū)分入口端和出口端之間的止回閥（如不易分清入口單向閥和出口單向閥），請劃線標(biāo)記或用標(biāo)簽標(biāo)記燒杯。將每個止回閥（單向閥）放入單獨(dú)的燒杯中進(jìn)行清潔，使其分開清潔。如果部件滑出，應(yīng)小心組裝，以免受到污染（無塵手套，避免劃傷部件等）。
隨著使用時間的增加，泵密封件（圈）會出現(xiàn)磨損；而且使用緩沖流動相或?qū)⑵渲糜诟啕}條件下（例如離子交換法），會縮短它的使用壽命。
您可以建立一個預(yù)防性維護(hù)計劃，定期更換密封件并做相應(yīng)記錄（準(zhǔn)確記錄更換密封圈的時間間隔，就可以建立預(yù)防性的維護(hù)計劃），從而在故障發(fā)生前更換密封件。如果無其它指標(biāo)（征兆），應(yīng)至少每年更換一次密封件（圈）。

2.5.比例閥和在線混合發(fā)生故障會降低梯度洗脫的效果（使梯度洗脫效果變差）。
圖6示例顯示了兩次連續(xù)注射肽樣品的梯度洗脫分析。在這種情況下，系統(tǒng)適用性測試允許兩次運(yùn)行之間存在0.1分鐘的變化（保留時間變化）；第一個峰值不符合該標(biāo)準(zhǔn)，最后一個峰值勉強(qiáng)通過而中間兩個峰值明顯超出規(guī)定值。 圖6. 兩個連續(xù)梯度運(yùn)行的（兩次連續(xù)梯度洗脫）色譜圖顯示了梯度中點(diǎn)附近的峰形具有較大的誤差（保留時間的誤差較大）（13分鐘）。來源[3]。


下面介紹了一種檢查流動相配比（混合）精度的簡單方法。
將柱更換為0.005英寸直徑約1米長（0.12mm）的管道（取下色譜柱，換上長約1米，內(nèi)徑0.005英寸（0.12mm）的管路），在A容器中加水，且B容器中放有含有0.1％丙酮的水，將檢測器波長設(shè)置為265nm，并使用足夠高的流速使止回閥（單向閥）能夠有效工作（例如2mL/min）。
以10％為增量運(yùn)行一系列梯級（梯級實(shí)驗）（10％、20％、30％……90％、100％B）。
由于問題經(jīng)常出現(xiàn)在50％B附近，所以在45％B和55％B處增添了額外的梯級。
其結(jié)果應(yīng)是平滑的階梯狀（參見圖8a）。
對于圖6的樣品，在40％-60％B的梯級中觀察到圖7的曲線。
梯級是扭曲的（已變形），且45％到50％B的梯級（梯級變化）是8.4％而不是5％。
圖7中的虛線近似于（擬合了該）梯度，同時（在）45％和50％B之間存在偏移。
因此，此處應(yīng)是由具有較大保留變量的峰被洗脫導(dǎo)致的（不幸的是，這正是那些保留時間偏差較大的峰出峰的位置）。
HPLC系統(tǒng)可對比例閥進(jìn)行調(diào)節(jié)。
當(dāng)執(zhí)行此操作時，梯級會變得平滑且保留時間也會處于規(guī)格范圍之內(nèi)。
  圖7. 在圖6的梯度中點(diǎn)附近執(zhí)行配比（比例）階梯測試的結(jié)果。理論值顯示在括號內(nèi)。來源[3]。


如果系統(tǒng)性能良好，其階梯測試的結(jié)果應(yīng)與圖8a類似，在整個圖中呈現(xiàn)階梯狀。
未注射的0-100％B梯度是應(yīng)運(yùn)行的對比測試（另需同時進(jìn)行一無進(jìn)樣的0-100%B梯度試驗）。
它應(yīng)顯示為線性基線、線性梯度部分和線性后期梯度保持，每個部分之間均是平滑的曲線過渡（線性梯度部分以及一段梯度升高后維持直線，每兩段之間為平滑曲線過度）。
圖9的示例顯示了在約25％、50％和75％B的線性（箭頭）條件下，空白梯度運(yùn)行呈現(xiàn)有規(guī)律的偏移。
  圖8. 圖9顯示了HPLC系統(tǒng)的梯度階梯測試結(jié)果。（a）0、10、20、30、40、45、50、55、60、70、80、90和100％B的梯級；（b）以1％的梯級向上跟蹤至45-55％。箭頭顯示了50和51％之間的“較短”梯級。來源[4]。

與這些條件相對應(yīng)的階梯測試如圖8a所示，并且在這個度量（放大比例）下表現(xiàn)良好。
為了更仔細(xì)地檢查問題區(qū)域，在45-55％B范圍內(nèi)以1％的增量進(jìn)行階梯測試，如圖8b所示。
這個擴(kuò)展（放大）圖清楚地顯示了在50％和51％之間的梯級中，存在不規(guī)則性。
在線性圖中的定期（有規(guī)律間隔的）誤差（圖9）表明，控制比例閥的算法或比例閥本身存在問題。
在目前的情況下，調(diào)整控制（控制軟件）軟件無法解決問題，因此應(yīng)更換比例閥，以解決問題（因此更換了比例閥，問題被解決）。 圖9. 故障比例閥線性梯度圖。箭頭顯示線性偏離；繪制下面的虛線以供參考（虛線為標(biāo)準(zhǔn)參考線）。以1mL/min的速度運(yùn)行梯度0-100％B 15分鐘；A =水、B = 0.1％丙酮水溶液；檢測UV 265nm。來源[4]。


盡管可以假設(shè)單一來源是導(dǎo)致特定HPLC問題的原因（雖然通�？梢约俣�某HPLC問題只有一個故障原因），但情況并非總是如此。
圖10a顯示了以非常淺的梯度（30分鐘內(nèi)19-24％ACN）連續(xù)三次注射肽樣品的結(jié)果（顯示了一種多肽樣品三次連續(xù)進(jìn)樣，窄梯度洗脫（30分鐘內(nèi)19-24%乙腈梯度洗脫））。
由于懷疑存在流量（流速）問題，因此在雙活塞雙泵系統(tǒng)中更換了所有8個止回閥（單向閥）和4個泵密封件（圈）。
這大大改善了保留變量（保留時間大為改善），保留范圍從2.1分鐘變化到1.0分鐘（圖10b），但仍然是（此偏差仍）不可接受的。
為了進(jìn)一步研究問題，將溶劑預(yù)混合到裝有15% ACN的A容器和裝有25％ACN的B容器中（在A瓶中預(yù)混合15% 乙腈，在B瓶中預(yù)混合25% 乙腈）。
當(dāng)調(diào)整儀器設(shè)置以產(chǎn)生與圖10a和b相同的梯度時，獲得圖10c所示的結(jié)果。盡管儀器的配比精度在±0.1％的規(guī)格范圍內(nèi)，但對于非常淺（窄）的梯度來說仍是不夠的。
預(yù)混合溶劑將有效精度從0.1％提高至0.01％，如果該樣品希望具有令人滿意的保留時間再現(xiàn)性，這點(diǎn)是必需的。
預(yù)混合可以提高系統(tǒng)性能，以滿足苛刻的分離要求。 圖10.三次連續(xù)注射肽樣品的擴(kuò)充（放大）色譜圖。產(chǎn)生的色譜圖：（a）使用原始系統(tǒng)配置（b）更換所有止回閥（單向閥）和泵密封件（圈）后（c）使用預(yù)混流動相。色譜柱：250×4.6mm、5mC18以1.5mL/min和35℃運(yùn)行，并在215nm檢測。梯度：30分鐘內(nèi)19-24％ACN / 0.1％TFA的水溶液。來源[5]。