HPLC故障排除3 - 鬼峰的出現(xiàn)及解決
3.鬼峰問題
3.1.等度分離中出現(xiàn)的意外寬峰是因前次運行產(chǎn)生的峰洗脫延遲（在等度分離中，前次運行中的遲洗脫組分以寬峰的形式意外出現(xiàn)）。
對于等度分離，保留時間越長，峰應(yīng)（色譜峰）越寬；但色譜圖狹窄區(qū)域內(nèi)的所有峰應(yīng)具有大致相同的峰寬。如圖11（箭頭）所示，當(dāng)窄峰中出現(xiàn)寬峰時，可能是因為之前注射（前次進(jìn)樣）的化合物發(fā)生了洗脫延遲。這很容易檢查。
只需進(jìn)行正常注射（進(jìn)樣），但將運行時間延長兩到三倍。如果在正常運行時間結(jié)束后出現(xiàn)峰值（出峰），那就是因洗脫延遲導(dǎo)致的。
可以通過延長正常運行時間，以涵蓋此峰的洗脫（洗脫時間將峰洗脫出來）；也可以在每次運行結(jié)束時加入強(qiáng)溶劑沖洗液，以（來）清洗柱中的頑固物質(zhì)。
圖11.峰延遲洗脫通常在38.5分鐘時出現(xiàn)（遲洗脫峰（正常情況下在第38.5分鐘出現(xiàn)的洗脫峰）），位于（出現(xiàn)在了）下一個縮短的等度運行的色譜圖的12.0分鐘（箭頭）處。來源[6]。
3.2.通過運行非注射（無進(jìn)樣）空白梯度并觀察基線，可以分離梯度運行中的鬼峰。
如圖12a所示，當(dāng)空白梯度出現(xiàn)過多的峰時，試劑污染可能是導(dǎo)致此問題的原因之一（可能是溶劑污染所致）。
在這種情況下，圖12a顯示運行過程中的峰值（峰）非常小（1-3 mAU），并且在0.8-1.0 AU范圍內(nèi)的主要成分分析中幾乎沒有峰值（對0.8-1.0 AU大小的主要成分檢測峰沒有影響）；但是對于穩(wěn)定性（性指標(biāo)檢測）或雜質(zhì)的測定，1-2 mAU范圍內(nèi)的峰值應(yīng)需要量化（也需要定量）。
在這種情況下，則需要進(jìn)一步的研究。
在梯度運行之間的平衡期間，流動相中的非極性雜質(zhì)一般沉積（聚集）在柱的頂部位置。然后，在梯度過程中，像其它峰一樣，這些雜質(zhì)被洗脫出來。
通過將平衡時間延長至三倍，檢查問題的根源。如果空白梯度中的峰值（峰）增加約三倍，則水狀溶劑最有可能是問題的致因（則極可能是水溶液中的雜質(zhì)所致）。
如圖12b所示，可將水和/或添加劑換成純度較高的成分，以解決這一問題。
圖12. 運行空白梯度：（a）A容器受到污染的水（A容器中溶劑有雜質(zhì)）和（b）A容器中純度較高的水。色譜柱：150x4.6mm C18；1.5mL/min；35℃；在255 nm處進(jìn)行UV檢測。梯度：0-83％ACN /水運行13分鐘，并保持5分鐘。來源[7]。
3.3.等度或梯度運行的負(fù)峰不如正峰常見（相對于正峰較為少見），但也會發(fā)生。
負(fù)峰在離子對或其它方法中更為常見，其中流動相試劑在選定的檢測波長下具有顯著的紫外線吸光度（倒峰在有離子對或流動相在檢測波段下有明顯紫外吸收的情況下更為常見）。
在這種情況下，背景吸光度將極為重要（背景吸收可能較顯著）（可能為0.5 AU或更多），但不會被注意到（較難覺察），因為系統(tǒng)在每次運行開始時會自動調(diào)節(jié)至零點，并檢測信號。
如果化合物的吸光度低于流動相背景（背景吸光度），其會顯示為負(fù)峰。
致因的確認(rèn)和峰的消除方式與正峰相同（確認(rèn)問題來源并消除倒峰的方法與正峰相同）：檢查水、試劑或樣品的制備過程。
| 鬼峰問題 | 預(yù)防措施和解決方案 |
| 鬼峰 | |
| 柱或注射器被污染 （色譜柱或進(jìn)樣器污染） | 僅使用HPLC級溶劑 沖洗柱，以去除雜質(zhì) 在注射器用于下一個分析物時，應(yīng)先進(jìn)行沖洗 |
| 前一個注射導(dǎo)致的遲洗脫峰（前一次進(jìn)樣的后洗脫峰） | 延長運行時間 每次運行結(jié)束時用強(qiáng)流動相沖洗色譜柱 對于梯度運行，應(yīng)以較高濃度結(jié)束（有機(jī)相比例結(jié)束梯度） |
| 在RP HPLC中，水被污染 | 1. 使用HPLC級水 |
| 樣本中的未知（未知雜質(zhì)）干擾 | 1. 使用樣品清理（凈化措施）（例如SPE） |
| 負(fù)峰 | |
| 溶質(zhì)折射率低于流動相（RI檢測器） | 使用折射率較低的流動相 調(diào)換檢測器極性以獲得正峰值 |
| 溶質(zhì)的吸收低于流動相的吸收（溶質(zhì)的紫外吸收低于流動相的紫外吸收）（UV檢測器） | 更改UV波長 使用UV吸收較低的流動相 |
| 樣品溶劑和流動相的成分不同 | 1. 如可能，更換樣品溶劑并將樣品溶解在流動相中 （更換樣品溶劑，如有可能，使用流動相溶解樣品） |
| 峰值（毛刺） | |
| 流動相中存在氣泡 | 對流動相脫氣 在檢測器出口端，安裝背壓限制器。 確保所有配件安裝緊固 |
| 柱儲存時未使用端帽 （堵頭） | 柱儲存時應(yīng)使用端帽 用脫氣的甲醇沖洗RP柱 |
3.1.等度分離中出現(xiàn)的意外寬峰是因前次運行產(chǎn)生的峰洗脫延遲（在等度分離中，前次運行中的遲洗脫組分以寬峰的形式意外出現(xiàn)）。
對于等度分離，保留時間越長，峰應(yīng)（色譜峰）越寬；但色譜圖狹窄區(qū)域內(nèi)的所有峰應(yīng)具有大致相同的峰寬。如圖11（箭頭）所示，當(dāng)窄峰中出現(xiàn)寬峰時，可能是因為之前注射（前次進(jìn)樣）的化合物發(fā)生了洗脫延遲。這很容易檢查。
只需進(jìn)行正常注射（進(jìn)樣），但將運行時間延長兩到三倍。如果在正常運行時間結(jié)束后出現(xiàn)峰值（出峰），那就是因洗脫延遲導(dǎo)致的。
可以通過延長正常運行時間，以涵蓋此峰的洗脫（洗脫時間將峰洗脫出來）；也可以在每次運行結(jié)束時加入強(qiáng)溶劑沖洗液，以（來）清洗柱中的頑固物質(zhì)。
圖11.峰延遲洗脫通常在38.5分鐘時出現(xiàn)（遲洗脫峰（正常情況下在第38.5分鐘出現(xiàn)的洗脫峰）），位于（出現(xiàn)在了）下一個縮短的等度運行的色譜圖的12.0分鐘（箭頭）處。來源[6]。
3.2.通過運行非注射（無進(jìn)樣）空白梯度并觀察基線，可以分離梯度運行中的鬼峰。
如圖12a所示，當(dāng)空白梯度出現(xiàn)過多的峰時，試劑污染可能是導(dǎo)致此問題的原因之一（可能是溶劑污染所致）。
在這種情況下，圖12a顯示運行過程中的峰值（峰）非常小（1-3 mAU），并且在0.8-1.0 AU范圍內(nèi)的主要成分分析中幾乎沒有峰值（對0.8-1.0 AU大小的主要成分檢測峰沒有影響）；但是對于穩(wěn)定性（性指標(biāo)檢測）或雜質(zhì)的測定，1-2 mAU范圍內(nèi)的峰值應(yīng)需要量化（也需要定量）。
在這種情況下，則需要進(jìn)一步的研究。
在梯度運行之間的平衡期間，流動相中的非極性雜質(zhì)一般沉積（聚集）在柱的頂部位置。然后，在梯度過程中，像其它峰一樣，這些雜質(zhì)被洗脫出來。
通過將平衡時間延長至三倍，檢查問題的根源。如果空白梯度中的峰值（峰）增加約三倍，則水狀溶劑最有可能是問題的致因（則極可能是水溶液中的雜質(zhì)所致）。
如圖12b所示，可將水和/或添加劑換成純度較高的成分，以解決這一問題。
圖12. 運行空白梯度：（a）A容器受到污染的水（A容器中溶劑有雜質(zhì)）和（b）A容器中純度較高的水。色譜柱：150x4.6mm C18；1.5mL/min；35℃；在255 nm處進(jìn)行UV檢測。梯度：0-83％ACN /水運行13分鐘，并保持5分鐘。來源[7]。
3.3.等度或梯度運行的負(fù)峰不如正峰常見（相對于正峰較為少見），但也會發(fā)生。
負(fù)峰在離子對或其它方法中更為常見，其中流動相試劑在選定的檢測波長下具有顯著的紫外線吸光度（倒峰在有離子對或流動相在檢測波段下有明顯紫外吸收的情況下更為常見）。
在這種情況下，背景吸光度將極為重要（背景吸收可能較顯著）（可能為0.5 AU或更多），但不會被注意到（較難覺察），因為系統(tǒng)在每次運行開始時會自動調(diào)節(jié)至零點，并檢測信號。
如果化合物的吸光度低于流動相背景（背景吸光度），其會顯示為負(fù)峰。
致因的確認(rèn)和峰的消除方式與正峰相同（確認(rèn)問題來源并消除倒峰的方法與正峰相同）：檢查水、試劑或樣品的制備過程。
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