蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南八

脫酰胺作用 - 蛋白質(zhì)和多肽反相HPLC分析和純化指南

蛋白質(zhì)在高溫或高pH值下會(huì)降解。
在脅迫條件下，最有可能發(fā)生的化學(xué)降解是酰胺側(cè)鏈上的天冬酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)樘於�氨酸或異天冬氨酸（圖37)。
天冬酰胺脫去酰氨基時(shí)，許多蛋白都會(huì)失去生物活性，但也有部分蛋白的生物活性不受影響。
即使脫酰胺作用不造成生物活性的減弱，脫酰胺作用也是蛋白接觸不利條件的指示。
特定天冬酰胺殘基脫酰胺的可能性取決于其在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中的位置。
只有那些與溶劑接觸表面接近的天冬酰胺殘基才會(huì)發(fā)生脫酰胺作用。
相鄰的氨基酸殘基同樣影響脫酰胺作用的可能性。與天冬酰胺相鄰的甘氨酸極大地增加了脫酰胺作用的可能性。
與天冬酰胺相鄰的亮氨酸和異亮氨酸等大分子疏水性氨基酸降低了脫酰胺作用的可能性。
由于脫酰胺作用會(huì)影響生物活性并能指示不利條件，因此慣常的做法是監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)治療藥物中天冬酰胺的脫酰胺作用。

圖37. 當(dāng)酰胺側(cè)鏈暴露在高溫和/或高pH條件下時(shí)，天冬酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸。

圖38. 人生長(zhǎng)激素脫酰胺作用的反相色譜分析

條件

色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米

流動(dòng)相：29% 異丙醇，71% 10 mM Tris鹽酸緩沖液、pH=7.5

這通常由反相高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)。
圖38顯示了通過(guò)完整蛋白分子的反相色譜法測(cè)量人生長(zhǎng)激素的脫酰胺作用的一個(gè)試驗(yàn)。
該試驗(yàn)pH為7.5，以使脫酰胺作用產(chǎn)生的天冬氨酸電離。
這使得脫酰胺的生長(zhǎng)激素相較于天然蛋白疏水性減弱，從而比天然蛋白先洗脫出來(lái)。

更常見(jiàn)的一種方法是通過(guò)肽圖中含天冬酰胺/天冬氨酸多肽的保留時(shí)間來(lái)測(cè)定脫酰胺作用。
在pH為2的肽圖中，含有天冬氨酸的脫酰胺肽的疏水性比含天冬酰胺的天然肽略強(qiáng)，因此比天然肽略晚洗脫出來(lái)，如圖39所示。
脫酰胺肽容易鑒別測(cè)定，為脫酰胺作用的判定提供了較好的方法。

圖39. 部分脫酰胺的核糖核酸酶的肽圖

條件

色譜柱：C18 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米

流動(dòng)相：5%~38% 乙腈—0.1% TFA體系，混合梯度洗脫，100分鐘。

有時(shí)，脫酰胺肽較難從天然肽中分離或會(huì)在肽圖中出現(xiàn)與其它肽的共洗脫峰。
如果分辨率不足，則可以增加pH。
如圖40所示，在低pH值下分離較差的脫酰胺肽能夠在6.5的高PH值下從天然肽中有效分離。
在部分脫酰胺的人生長(zhǎng)激素的低pH肽圖中（圖40A），脫酰胺肽出峰稍晚于天然肽，但與肽圖中的另一種肽未分離。
對(duì)肽峰進(jìn)行收集后以更高的pH（pH6.5）重新進(jìn)行色譜分離。在高pH值下，脫酰胺肽中的天冬氨酸被電離，出峰早于含天冬酰胺的天然肽，且峰形好（圖40B）。

圖40. 部分脫酰胺的人生長(zhǎng)激素的肽圖中脫酰胺肽從天然肽的分離。

A pH=2時(shí)，部分脫酰胺的hGH的肽圖（0.1% TFA）

B 收集含天然肽（頂部）和脫酰胺肽（底部）的肽圖A中的肽段，在6.5的pH下重新進(jìn)行色譜分析。

色譜柱：C4 寬孔柱， 4.6 x 250 毫米

A. 流動(dòng)相：乙腈-0.1% TFA體系梯度洗脫，pH 2.0	B. 流動(dòng)相：乙腈-30 mM 磷酸鈉體系梯度洗脫，pH 6.5