如何進行WB實驗質(zhì)控呢

蛋白樣品：

準備好裂解液后，使用BCA或Bradford等檢測方法仔細測量蛋白濃度。進行上樣時，確保加入等量的蛋白樣品，以確保公平比較，從而最大限度地減少上樣誤差。不要使凝膠過載！如果您的表達目標非常低，可選擇加樣孔體積大的凝膠，這樣可提高上樣量。

陽性和陰性對照：

這些質(zhì)控對于證明您的結果有效至關重要。陽性對照通常是裂解物或組織提取物，其具有過度表達的蛋白。當您的陽性對照未能發(fā)出信號時，您知道該方法可能存在問題。如果您正在使用重組蛋白，那么包含內(nèi)源形式靶標的陽性對照也是一個好主意。這將有助于理清與一抗相關的任何特異性問題。陰性對照同樣也有價值，通常是不會產(chǎn)生目標的裂解物或組織提取物。最好的陰性對照由敲除或未處理的細胞系制備。

內(nèi)參對照：

有幾種廣泛可用的上樣對照抗體，如GAPDH，actin 或 tubulin。由于這些蛋白表達豐度高，因此在適應低豐度目標的樣品表達看到內(nèi)參對照蛋白的過飽非常常見。這里最大的挑戰(zhàn)是內(nèi)參對照和靶蛋白在相同的樣品稀釋系列中通常具有不同的線性，影響定量的準確性，對于目的蛋白表達比較低的蛋白，可選擇低表達的內(nèi)參例如Lamin B1和HSP60等蛋白。此外，研究人員需要證明內(nèi)參蛋白的表達不會因?qū)嶒灄l件的變化而改變。

在第一個檢測線性范圍重疊的地方，蛋白質(zhì)在該重疊區(qū)域內(nèi)的定量將是很好的。然而，在后者中，它們不重疊，容易看出蛋白質(zhì)濃度的變化如何影響一種蛋白條帶強度，而不影響另一種蛋白質(zhì)的條帶強度。在這種情況下，定量是不準確的。

轉(zhuǎn)移效率/總蛋白標準化：

轉(zhuǎn)印完成后，最好評估轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白量以及凝膠中剩余的蛋白量。通過評估整個蛋白范圍，產(chǎn)生更廣泛的動態(tài)范圍。這些染色包括凝膠和膜染色，并且可以以各種不同的方式成像。例如AzureRed熒光蛋白染色是一種用于凝膠和印跡膜的定量總蛋白染色試劑，與下游蛋白分析兼容。AzureRed是染色應用的理想選擇，包括轉(zhuǎn)印后染色以確認從凝膠到膜的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移情況，以及定量蛋白。執(zhí)行這些檢查不僅可以讓您對實驗的進展充滿信心，現(xiàn)在很多期刊雜志都推薦使用總蛋白定量的方法來進行質(zhì)控，以證明數(shù)據(jù)的可重復性和準確性。

圖1. AzureRed與三種感興趣的蛋白同時成像。 

向凝膠中加入稀釋的HeLa細胞裂解物。轉(zhuǎn)印后，將印跡用AzureRed染色，然后在不脫色情況下加入tubulin，ß-actin和GAPDH探針。用Azure Sapphire 雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)掃描成像。四個通道進行疊加，總蛋白質(zhì)（AzureRed染色）以灰色顯示;tubulin-紅色，ß-actin-藍色和GAPDH-綠色。

不加入一抗：

這是一個簡單但經(jīng)常被遺忘的WB印跡控制。通過僅僅加入二抗孵育印跡，您將能夠清楚地看到由于實驗中使用的二抗而產(chǎn)生非特異性的條帶。