簡述基因治療的最新臨床研究進展
基因療法以其“一次給藥，終身受益”的優(yōu)勢越來越受到醫(yī)療市場的青睞。截至目前，歐洲藥品管理局（EMA）、美國食品藥品管理局（FDA）及中國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（NMPA）等機構(gòu)至少已批準13種基因治療產(chǎn)品上市，同時還有2500多項細胞和基因治療正在進行臨床試驗。2019年8月，國際頂級期刊《新英格蘭醫(yī)學雜志》（簡稱NEJM）發(fā)表了題為《Gene Therapy》的最新綜述，從基本原理出發(fā)，介紹了目前為止基因治療的臨床應(yīng)用和上市藥物，并著重討論了基因治療現(xiàn)階段存在的問題和挑戰(zhàn)[1]。本文基于這篇綜述，重點從病毒載體的角度來介紹一下當前基因治療的發(fā)展現(xiàn)狀。
01、傳統(tǒng)藥物面臨挑戰(zhàn)，基因藥物蓄勢待發(fā)
現(xiàn)代醫(yī)學目前還以化學療法，放射療法和外科手術(shù)為主。其中許多藥物都是化學合成藥劑，旨在改變身體的化學反應(yīng)并產(chǎn)生依賴性，并且通過減少疾病的癥狀和延長患者的壽命來實現(xiàn)暫時的緩解。然而，這些傳統(tǒng)藥劑面臨許多挑戰(zhàn)：包括溶解度和生物利用度低，體內(nèi)物理化學性質(zhì)不穩(wěn)定，循環(huán)半衰期短，體內(nèi)滲透性低，組織分布性差以及高劑量易引起毒性。
以蛋白類藥物為例，基于蛋白質(zhì)和肽類的藥物已成為目前市面最常用的治療藥物，目前全世界有近380種市售藥物。然而，將治療性蛋白質(zhì)引入患者體內(nèi)的一個不利因素將會導(dǎo)致嚴重的免疫反應(yīng)，炎癥和發(fā)熱癥狀。為了解決這一系列的問題，高質(zhì)量治療性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝變得極為復(fù)雜，但是目前開發(fā)治療性蛋白的工藝涉及5000多個關(guān)鍵步驟。因此，開發(fā)化學和蛋白療法的不可預(yù)測性太高，時間和投入成本太大。
基因療法能實現(xiàn)治療性蛋白的長期表達和組織特異性表達，無需藥物干預(yù)，放療或手術(shù)治療，即可從根源上解決傳統(tǒng)療法存在的一系列問題。并且這一新興的治療方法可針對單基因遺傳病，心血管疾病，免疫缺陷性疾病和癌癥等多種疾病。
02、基因治療的基本原理及分類
基因治療是指將功能基因遞送到患者體內(nèi)，以替換或糾正功能障礙，從而治愈疾病。鑒于基因遞送方式的不同，基因治療主要分為離體和在體基因療法兩大類：（如下圖所示）
圖1. 基因治療的2種方式（體外-左；在體-右）[1]
1. Ex vivo
▲ 又稱離體基因治療，從患者體內(nèi)分離細胞，將整合載體在體外導(dǎo)入這些細胞，進行基因工程改造，隨后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。
▲ 治療疾病的代表：CAR-T細胞免疫療法[2]、地中海貧血和鐮狀細胞貧血。EMA獲批的由BlueBird Bio公司開發(fā)的Zynteglo就是一種基于慢病毒載體的離體基因療法[3]。
2. In vivo
▲ 又稱在體基因治療，是將非整合載體直接注射給患者，使得功能性矯正基因被遞送至患者體內(nèi)，恢復(fù)疾病正常表型。
▲ 治療疾病的代表：先天性黑朦癥[4]，脊髓性肌萎縮癥[5]和血友病[6, 7]等。
二者各自優(yōu)勢和挑戰(zhàn)
離體基因治療：由于利用自體細胞，因而不會產(chǎn)生免疫反應(yīng)；同時還可在體外篩選到高效轉(zhuǎn)導(dǎo)以及無脫靶的細胞，進而實現(xiàn)高效安全的治療效果。但由于步驟繁瑣，細胞活力低等缺點也受到一定的局限。此外，整合型載體的使用更易引起體內(nèi)的隨機插入，進而產(chǎn)生癌變也是亟需解決的問題之一。
在體基因治療：由于其操作簡便，對于一些體外無法培養(yǎng)的細胞類型是最優(yōu)選擇。但由于體內(nèi)編輯的不確定性，無法避免很多隨機整合或脫靶等事件，并且一些病毒載體還會使機體出現(xiàn)危及生命的免疫反應(yīng)。因此，開發(fā)和優(yōu)化新型的基因遞送載體系統(tǒng)，使治療基因能更安全有效地遞送到靶向細胞或組織，將極大地促進基因治療在臨床應(yīng)用中的進程。
03、理想的載體是基因治療的關(guān)鍵
如上所述，不管是體內(nèi)還是體外基因治療，理想載體的選擇是基因治療成敗的關(guān)鍵，它們應(yīng)該具備以下幾個特點：
▲ 有足夠的空間來遞送大片段的治療基因；
▲ 具有高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，能感染分裂和非分裂的細胞；
▲ 能靶向特定的細胞，且可以長期穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)基因；
▲ 具有較低的免疫原性的或致病性，不會引起炎癥；
▲ 具備大規(guī)模生產(chǎn)的能力。
因此，尋找合適的載體一直是基因治療的重要研究領(lǐng)域。目前針對基因治療的載體一般分為病毒和非病毒載體。下圖展示了臨床試驗中各種遞送載體的占比情況，病毒載體是基因療法最常用的遞送系統(tǒng)（主要包括ADV、RV、AAV等），它也是世界上第一個用于基因治療的臨床研究載體。
圖2. 不同載體的臨床試驗占比
1. 非病毒載體：主要通過物理和化學方法來轉(zhuǎn)導(dǎo)治療性遺傳物質(zhì)，包括針，基因槍，電穿孔，聲孔效應(yīng)，光致成像，磁場轉(zhuǎn)換，加氫，機械按摩，脂質(zhì)體，磷酸鈣，二氧化硅和金納米粒子等。然而，由于它們操作復(fù)雜且存在固有的缺陷，其在基因治療的效果無法滿足臨床的需求。
2. 病毒載體：相較于非病毒載體，病毒載體更符合理想載體的要求，因此，大量研究人員正集中開發(fā)新型的病毒載體，以求基因治療能夠安全有效地治愈人類疾病。
截至目前已被用于基因治療的病毒載體主要有以下幾種：
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（RV）
▲ 一類可將RNA基因組反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA并整合到宿主細胞染色體中的病毒。
▲ 分類：兩種最常見的逆轉(zhuǎn)錄病毒類型是γ逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒，它們分別來自MLV和HIV-1。
▲ 適用范圍：成熟的RV可以感染多種體細胞，包括胚胎干細胞，造血干細胞和神經(jīng)干細胞。利用活性核元件，這些載體可以只將治療基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到增殖細胞中，因此非常適合用于特異性靶向癌細胞。
▲ 裝載容量：可達8kb。
▲ 缺點：RV的一個重大隱患是整合酶可以將病毒的基因組插入到宿主基因組中的任何位置，可能會導(dǎo)致某些關(guān)鍵基因的失活（插入突變）或者是導(dǎo)致細胞無限增殖（癌變）。
1. RV在臨床試驗中最新進展：
迄今為止RV載體已進行了500多項基因治療的臨床試驗，如癌癥，地中海貧血，HIV，ADA-SCID，黑素瘤，WAS等，下表羅列了目前已開展的基于RV的重要臨床試驗研究：
2. RV載體用于臨床試驗存在的主要問題和解決方案：
▲ 由于免疫反應(yīng)是RV病毒介導(dǎo)的基因治療的主要障礙，因此設(shè)計可以破壞補體系統(tǒng)的病毒載體至關(guān)重要。
▲ RV的LTR用作各種核蛋白的啟動子，增強子，結(jié)合位點，染色質(zhì)調(diào)節(jié)劑和多腺苷酸化信號。因此，應(yīng)用基因工程和CRISPR技術(shù)可能規(guī)避插入突變的問題。另外通過在治療期間使用非整合的RV載體或整合酶抑制劑也可以避免該問題。
▲ 開發(fā)引導(dǎo)和監(jiān)測宿主細胞染色質(zhì)中轉(zhuǎn)基因插入的技術(shù)也將有助于RV介導(dǎo)的基因治療。
▲ 盡管RV載體可以遞送高達10kb的轉(zhuǎn)基因序列，但高滴度病毒的制備，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)以及插入位點附近表觀遺傳的修飾仍然是臨床應(yīng)用存在的主要問題。
▲ 由于病毒感染取決于靶細胞表面受體和病毒包膜蛋白的表達，因此設(shè)計和構(gòu)建有效組織特異性重組RV載體對于良好的臨床結(jié)果是必要的。
腺病毒載體（ADV）
▲ 第一個基因治療開發(fā)的病毒載體，于1990年被批準用于臨床試驗。它于1953年首次從人類腺體組織來源的細胞培養(yǎng)物中分離出來，因此稱為腺病毒。含有多個家族成員，是一種無包膜的雙鏈DNA（dsDNA）病毒，也稱為腺病毒科。
▲ 分類：ADV到目前已改進到第三代病毒系統(tǒng)，也稱為無病毒基因組或輔助依賴性ADV載體，缺乏除ψ和ITR序列外的所有病毒基因序列。能維持長期的轉(zhuǎn)基因表達能力，以及較少的復(fù)制病毒顆粒的污染。其免疫原性也低于第一代和第二代載體。
▲ 裝載容量：高達37kb。
▲ 缺點：強免疫原性。
1. ADV在臨床試驗中最新進展：
ADV載體在整個病毒介導(dǎo)的臨床研究中的比例約24%（如上圖所示），主要集中在疫苗接種和溶瘤治療，也正被測試用于瘧疾，炭疽，HIV，流感，乙型肝炎和丙型肝炎，以及嚴重血友病以及心血管和更多疾病的臨床試驗。下表羅列了目前已開展的基于ADV的重要臨床試驗研究：
2. ADV載體用于臨床試驗存在的主要問題和解決方案：
大量臨床試驗得到了令人鼓舞的結(jié)果，特別是在癌癥治療中，預(yù)計ADV介導(dǎo)的基因治療不久的將來會在根除癌癥中發(fā)揮重要作用。雖然ADV介導(dǎo)的基因治療較其他系統(tǒng)具有獨特的優(yōu)勢，但必須解決以下幾個問題才能真正發(fā)揮其在臨床治療中的真正潛能：
▲ 開發(fā)可避免內(nèi)源性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活和細胞因子的產(chǎn)生的新型ADV是至關(guān)重要的，因為抗體免疫應(yīng)答的產(chǎn)生可能會使臨床操作復(fù)雜化。
▲ ADV的有效感染對于整合素和CAR蛋白在靶細胞或組織上的表達的依賴性限制了其在更多疾病中的治療前景。因此，開發(fā)高特異性感染的新型ADV載體也是非常有必要的，以求提高轉(zhuǎn)基因表達達到治療水平，誘導(dǎo)更低的器官毒性和炎癥，并且可以在體內(nèi)更加容易檢測。
▲ 了解疾病特異性生物標志物，設(shè)計和工程化改造攜帶細胞或組織特異性受體結(jié)合表位的新型ADV衣殼也可以減少臨床副作用的產(chǎn)生。
▲ 由于ADV中和抗體的存在因患者而異，因此設(shè)計和開發(fā)患者個性化的特異性衣殼將是未來ADV治療疾病的趨勢。
▲ 開發(fā)抗血清蛋白失活的ADV載體將有助于提高靜脈內(nèi)注射病毒的治療效果，但仍需要制定劑量相關(guān)毒性的解決策略。
▲ 復(fù)制感染病毒的污染仍然是治療性ADV制劑大規(guī)模生產(chǎn)中的重大問題。因此，需要進一步推進ADV的純化工藝以及基于AV的基因遞送技術(shù)的研發(fā)，以充分發(fā)揮其基因治療的潛力。
腺相關(guān)病毒載體（AAV）
▲ 一類具有單鏈和無包膜的DNA的病毒，可感染分裂和非分裂細胞。AAV以游離形態(tài)存在于細胞中的能力使它們成為基因治療的優(yōu)良候選者。這些病毒的另一個顯著特征是它們在沒有腺病毒和皰疹病毒作為輔助病毒的情況下對人體不具有致病性。在沒有輔助病毒的情況下，這些病毒可以將它們的遺傳物質(zhì)插入到19號染色體上的特定位置。
▲ 分類：AAV具有多種常見血清型，100多種病毒變種。不同血清型的AAV具有不同組織特異性。
▲ 裝載容量：不超過5kb。
▲ 缺點：人體本身就是AAV的天然宿主，因而會存在抗AAV血清型的中和抗體。有限的包裝容量限制了其在更多疾病治療中的應(yīng)用。
1. AAV在臨床試驗中最新進展：
目前AAV載體已被用于200多項臨床試驗來治療多種疾病，占所有基因治療臨床研究的8.1%。包括A/B型血友病、先天性黑蒙癥、遺傳性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良、全色盲和Leber的遺傳性視神經(jīng)病變（LHON）。此外，還有許多臨床試驗正在測試用AAV來治療溶酶體貯積癥、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）、癲癇、1型脊髓性肌萎縮、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、芳香族L-氨基酸脫羧酶缺乏癥（AADC），以及巴特病等。下表羅列了目前已開展的基于AAV的重要臨床試驗研究：
2. 臨床試驗研究AAV介導(dǎo)的幾類重要疾病介紹：
▲ 癌癥基因治療：許多AAV載體正被用于測試抗血管生成，細胞毒性，細胞因子和腫瘤抑制基因，小RNA，抗原和抗體的表達來治療癌癥。大量臨床前研究顯示，使用AAV介導(dǎo)的基因治療可改善腫瘤的消退[8, 9]。
▲ 靶向肝臟基因治療：以肝臟或其他器官為目標對AAV載體進行的全身性血管內(nèi)給藥已在多重度遺傳病中獲得了良好的臨床結(jié)果。通過向患者體內(nèi)遞送FIX對嚴重B型血友病的成功治療被認為是基因治療臨床應(yīng)用的里程碑[7]。在正在進行的I / II期臨床試驗中，F(xiàn)VIII和FIX分別被遞送給A型和B型血友病患者。另外針對粘多糖血癥的治療藥物SB-318和SB-913的I / II期臨床試驗也正在進行中。
▲ 視力損傷基因治療：視網(wǎng)膜作為一個相對“免疫特赦”的器官被視為載體介導(dǎo)的基因治療的理想位點，僅需較小的劑量就可達到最佳的效果�；贏AV介導(dǎo)的先天性黑朦癥基因治療藥物Luxturna™已獲批上市[4]。2019年7月，Edita公司開展了針對先天性黑蒙癥10-型的基因治療的I / II期期臨床研究。這將有可能成為全球第一個獲批上市的基于AAV介導(dǎo)治療10-型萊伯氏先天性黑朦疾病的在體 CRISPR 基因編輯藥物[10]。
▲ 脊髓性肌萎縮基因治療：基于AAV介導(dǎo)的基因治療的另一個成功案例是脊髓性肌萎縮的治療，由運動神經(jīng)元存活蛋白-1（SMN1）基因突變是引發(fā)該疾病的主要原因。2019年美國美國FDA批準了由Novartis公司AveXis Inc.開發(fā)的基于AAV介導(dǎo)體內(nèi)表達SMN1蛋白的藥物Zolgensma[5]。
3. AAV載體用于臨床試驗存在的主要問題和解決方案：
盡管AAV載體是安全非致病的，但它們在基因治療中的應(yīng)用受制于有限的裝載容量（不超過5Kb），衣殼蛋白引起的免疫原性，生產(chǎn)工藝困難，大劑量高度純化載體的需求，普遍的趨向性以及在人群中存在廣泛的抗AAV抗體（208-211）�；贏AV的基因治療是目前最為安全有效的治療方式，因而優(yōu)化AAV病毒載體對于基因治療在臨床中的應(yīng)用至關(guān)重要：
▲ 由于AAV主要是衣殼與靶細胞相互接觸，因此，更好地理解T細胞對各種AAV血清型的反應(yīng)將減少炎癥、免疫應(yīng)答和其他病毒顆粒相關(guān)的副作用、設(shè)計和開發(fā)更多嵌合衣殼蛋白對于構(gòu)建組織特異性的病毒顆粒是至關(guān)重要的。
▲ 更好地理解AAV顆粒在疾病特異性環(huán)境中潛在的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運機制將有助于開發(fā)改善基因遞送效率的策略。對于患者通過免疫赦免部位（如中樞神經(jīng)系統(tǒng)，粘膜表面，眼睛，胎盤，胎兒，睪丸和關(guān)節(jié)軟骨）注射AAV可能是避免T細胞反應(yīng)的更好選擇。
▲ 盡管AAV載體被證實在不整合到宿主的染色體中可實現(xiàn)長達1年的治療基因的表達，但應(yīng)用CRISPR / Cas9技術(shù)將解決長期表達和誘變的問題。
04、已上市的基因治療藥物
隨著病毒遞送載體和基因編輯技術(shù)的進步，自2003年以來，至少有十幾種基因治療產(chǎn)品問世（如下圖所示）：
圖3. 近年來上市的基因治療藥物
1. Gendicine™是全球首個獲批的基因治療藥物，由深圳SiBiono GeneTech開發(fā)，用于治療攜帶p53基因突變的腫瘤患者。Gendicine™是一種攜帶野生型p53基因的復(fù)制缺陷型腺病毒(Ad-p53)，可通過刺激腫瘤細胞中的凋亡途徑，增加腫瘤抑制基因和免疫應(yīng)答因子的表達進而殺傷腫瘤。中國國家食品藥品監(jiān)督管理局于2003年10月16日批準了Gendicine™用于頭頸部鱗狀細胞癌的治療[11]。
2. Oncorine™是另一種攜帶p53基因治療頭頸癌的基于復(fù)制缺陷ADV的藥物，于2005年在中國上市，由上海雙威生物科技有限公司開發(fā)。Oncorine™是通過重組的方式刪除人5型腺病毒E1B-55kD和E3區(qū)部分基因片段而獲得的一種溶瘤性腺病毒，它可在p53功能缺陷的腫瘤細胞中選擇性復(fù)制而誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡，而不會對正常細胞產(chǎn)生明顯毒副作用[12]。
3. Rexin-G™是一種嵌合逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，裝載有細胞殺傷性顯性負性的細胞周期蛋白G1基因以靶向并殺死實體腫瘤，于2005年獲得菲律賓FDA的批準。由Epeius Biotechnologies Corporation開發(fā)的Rexin-G™被指定為美國FDA作為胰腺癌的孤兒藥。最近的臨床研究結(jié)果證實了該藥物在安全性，抗腫瘤性以及增加患者生存時間和存活率的潛力[14]。
4. Imlygic™是一種用于治療無法通過手術(shù)去除的黑色素瘤的轉(zhuǎn)基因HSV療法，命名為T-VEC（Imlygic™），于2015年上市，是第一個也是唯一FDA批準可直接注入黑色素瘤的基因藥物。T-VEC可直接殺死轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞并增強對它們的免疫應(yīng)答。這種先進的溶瘤病毒在腫瘤細胞中復(fù)制并合成粒細胞 - 巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF），從而導(dǎo)致腫瘤抗原的腫瘤裂解和釋放，從而引發(fā)免疫反應(yīng)。T-VEC在歐洲和澳大利亞已被批準用于黑色素瘤的治療[13]。
5. Strimvelis™[15]是另一種基于逆轉(zhuǎn)錄病毒用于治療超罕見的免疫缺陷綜合癥（ADA-SCID）的藥物，于2016年被EMA批準上市。它是第一個用于治療ADA-SCID的體外干細胞基因療法，也是第二個被歐盟批準上市的基因療法。Strimvelis™利用RV將ADA基因拷貝插入到患者骨髓提取的干細胞染色體中。然后將攜帶ADA基因的干細胞重新注入患者體內(nèi)并可表達腺苷脫氨酶，從而修復(fù)患者的免疫系統(tǒng)。盡管臨床結(jié)果顯示Strimvelis™針對疾病的緩解率可達100％，但目前仍傾向于使用具有較低插入誘變風險的自失活逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，如慢病毒載體。
6. Zalmoxis® 是另一種基于供者來源T細胞的自殺基因免疫療法，于2016年被EMA有條件性批準用于治療部分白血病和淋巴瘤。該方法使用RV遺傳修飾異體來源的T細胞以表達1NGFR和HSV-TK Mut2自殺基因，因而可以隨時使用更昔洛韋（ganciclovir）藥物殺死引起不良免疫反應(yīng)的T細胞。帶有“自殺基因”的T細胞表達前藥轉(zhuǎn)換酶HSV-TK，后者可磷酸化激活更昔洛韋的細胞毒活性，從而誘導(dǎo)T細胞“自殺”，防止可能出現(xiàn)的GVHD進一步惡化[18]。
7. Kymriah™是一種基于慢病毒的嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）來治療非霍奇金淋巴瘤（NHL）和B細胞急性淋巴細胞白血�。ˋLL）患者的基因療法，于2017年被美國FDA批準上市。Kymriah™是一種新型免疫細胞療法，它使用患者自身重編程的T細胞編碼轉(zhuǎn)基因CAR來鑒定和消除表達CD19的惡性和非惡性腫瘤細胞，整體的治療緩解率可達83％[16]。
8. Yescarta™是另一種基于逆轉(zhuǎn)錄病毒的CAR-T細胞免疫療法，由吉利德公司Kite開發(fā)，并于2017年獲得FDA批準。使用NHL患者自身T細胞并使用RV進行遺傳修飾以產(chǎn)生與CD28和CD3-zeta共刺激結(jié)構(gòu)域連接的抗CD19的CAR，以幫助對抗淋巴瘤。僅在美國，約有7,500名難治性DLBCL患者有資格接受Yescarta™治療[17]。
9. Luxturna™于2017年被FDA批準作為治療Leber先天性黑朦的孤兒藥，也是首個用于治療失明的基于病毒類的藥物。攜帶有野生型RPE65的AAV2被用于治療雙等位基因RPE65突變相關(guān)的視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良的患者，可在幾個月內(nèi)恢復(fù)其視力[4]。
10. Spinraza®已成為首個批準用于治療罕見且致命的脊髓性肌萎縮癥（SMA）的治療方法。Spinraza®是一種反義寡核苷酸（ASO），治療由5號染色體上SMN1基因突變所引起的脊髓性肌萎縮癥。Spinraza®改變SMN2前mRNA的拼接，從而增加全長SMN蛋白的生產(chǎn)，可有效增加SMA患者中全長SMN蛋白的數(shù)量。目前的臨床數(shù)據(jù)顯示Spinraza®在治療SMA方面的顯著療效和廣泛的適用性。此外，由Novartis公司AveXis Inc.開發(fā)的基于AAV介導(dǎo)的在患者中表達SMN1蛋白的藥物Zolgensma已于2019年被美國FDA批準用于治療SMA[19]。
11. Zynteglo是由Bluebird Bio開發(fā)的一款基于慢病毒的自體干細胞療法，于2019年獲得EMA有條件批準用于治療12歲及以上的非β0 /β0基因型輸血依賴性β-地中海貧血(TDT)患者。通過慢病毒載體將具備功能的人βA-T87Q-珠蛋白基因?qū)氲綇幕颊唧w內(nèi)取出的造血干細胞中，再將這些干細胞回輸?shù)襟w內(nèi)，使患者能自主生成β-珠蛋白，從而消除或大幅降低繼續(xù)輸血治療的必要性。臨床數(shù)據(jù)顯示，該療法可以使特定基因型TDT患者免于輸血長達3.8年[3]。
05、新興基因編輯技術(shù)推動臨床發(fā)展
截至目前，基于基因療法的臨床試驗及上市藥物主要以外源基因增補的方式通過病毒遞送來治療疾病，雖然這一方式取得了顯著療效，但仍然無法實現(xiàn)疾病長期治愈的可能，這主要歸因于病毒載體（如慢病毒）插入突變，ADV載體顯著的肝毒性以及AAV載體以游離態(tài)形式會隨細胞分裂增殖而丟失，或因產(chǎn)生的遲發(fā)性免疫反應(yīng)所清除等諸多因素。為了解決這一問題，新興的以核酸內(nèi)切酶為基礎(chǔ)的基因編輯技術(shù)（如ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9）正被科學家們開發(fā)用于疾病的治療。
基因編輯技術(shù)通過核酸內(nèi)切酶靶向切割基因組形成DSBs，通過NHEJ的方式產(chǎn)生Indel導(dǎo)致基因敲除，在有模板存在的條件下可通過NHEJ或HDR的方式發(fā)生靶向整合，對異�；蜻M行定點修復(fù)或?qū)⒅委熁虬邢蛘系交蚪M中，成功編輯的細胞可以傳遞給子代，以實現(xiàn)疾病的長期修復(fù)效果。
隨著病毒載體和基因編輯技術(shù)的不斷優(yōu)化，基于基因編輯技術(shù)的多項臨床試驗也陸續(xù)在進行中，其中包括：
▲ 利用鋅指核酸酶（ZFN）治療HIV-193的臨床試驗，以及三項由ZFN 介導(dǎo)治療基因體內(nèi)插入肝細胞白蛋白位點治療粘液多發(fā)性硬化癥I/II型和B型血友病的臨床試驗。
▲ 針對急性髓性白血病和母細胞性漿細胞樣樹突狀細胞腫瘤的靶向 CD123 的同種異體 TALEN 編輯的CAR-T 細胞的早期試驗也已經(jīng)啟動。
▲ 最近，由Editas聯(lián)合制藥公司Allergan共同開啟了通過AAV和CRISPR敲除CEP290內(nèi)含子突變治療10型先天性黑朦癥的1/2期臨床試驗[10]。
另外還有許多基因編輯治療方法尚處于基礎(chǔ)研究階段，未來有希望進入臨床來治療更多疾病。基于基因編輯技術(shù)的拓展應(yīng)用，如表觀遺傳調(diào)控以及目前最火熱的單堿基編輯技術(shù)的開發(fā)應(yīng)用也勢必將會促進基因編輯技術(shù)在臨床治療中的廣泛應(yīng)用。
基因療法的安全性及展望
基因療法目前主要以病毒載體遞送為主，對病毒載體最為關(guān)注是免疫反應(yīng)、脫靶效應(yīng)、炎癥和插入誘變的風險。免疫應(yīng)答可能使病毒治療效率降低，或者由此產(chǎn)生的抗體可能使二次給藥無效。炎癥反應(yīng)被認為是1999年高劑量腺病毒引起Jesse Gelsinger死亡的主要原因[20]。為了降低這些安全問題，為患者量身定制病毒劑量可以更好地控制這種風險。此外，插入誘變是基因治療領(lǐng)域必須克服的主要困難。對于隨機整合的載體，例如RV，存在將基因插入腫瘤抑制基因或激活癌基因的風險。為了解決這一問題，可以使用非整合型載體。另外，還可以制備不含自身啟動子的自失活載體，利用細胞中的內(nèi)源啟動子可顯著降低遺傳毒性，是傳統(tǒng)整合載體更安全的替代品。為了解決AAV包裝容量的限制，使用雙AAV載體系統(tǒng)可實現(xiàn)更大基因遞送的能力。
基因治療的未來會朝著更安全、更高效的載體工程方向發(fā)展，結(jié)合多種現(xiàn)有策略，如病毒載體與基因工程技術(shù)相結(jié)合，針對患者進行個性化基因治療�？傊�，基因治療的進展為許多迄今無法治愈的疾病帶來了令人興奮的新治療機會。然而，要克服這類新型藥物帶來的困難險阻并實現(xiàn)其全部治療潛力，我們?nèi)孕枰獜娪辛η页掷m(xù)的合作努力。
隨著更多基因治療臨床試驗的進行，今后將會出現(xiàn)更多的基因治療藥物批準上市，更多類型疾病的治療將不再是夢想。然而，我們也要認識到目前已上市的基因治療藥物所存在的問題，諸如審批流程復(fù)雜、價格昂貴以及需求量低等，建立合理的審批流程、制定合適的定價策略，將會為基因治療藥物的發(fā)展提供充足的保障。
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