活細(xì)胞雙色動(dòng)態(tài)超高分辨率成像之STED標(biāo)記方法

隨著技術(shù)的發(fā)展，在超高分辨率顯微成像技術(shù)的使用上，科學(xué)家已經(jīng)不滿(mǎn)足于只觀(guān)察固定細(xì)胞或組織的亞細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)，活細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)超高分辨率追蹤由于可以提供常規(guī)顯微鏡下無(wú)法觀(guān)察到的更接近自然狀態(tài)的微觀(guān)變化，日益成為研究人員競(jìng)相涉足的領(lǐng)域。

STED (Stimulated emission depletion, 受激發(fā)射損耗) 超高分辨率成像是純光學(xué)意義上的超高分辨率技術(shù)，成像過(guò)程只需打開(kāi) STED 激光而無(wú)需后期計(jì)算，就可以快速得到超高分辨率圖像。因此在活細(xì)胞動(dòng)態(tài)超高分辨成像方面，相比其他的超高分辨率技術(shù)，STED 存在先天的優(yōu)勢(shì)。
 

▲ 圖 1. 多色超高分辨率顯微成像：3 個(gè) STED通道 + 1 個(gè)共聚焦通道。

STED：Alexa 647-波形蛋白 (紅色)、Alexa 594 -α 微管蛋白 (綠色)、Alexa 488-微絲 (青綠色)。共聚焦：DAPI-DNA (藍(lán)色)。致謝：Eugene Katrukha，荷蘭烏特勒支大學(xué)

有機(jī)染料的開(kāi)發(fā)

眾所周知，超高分辨率成像技術(shù) (包括 STED) 都需要將目標(biāo)結(jié)構(gòu)標(biāo)記上熒光比較強(qiáng)且光穩(wěn)定性好的染料，特別是活細(xì)胞超高分辨率成像就更是如此。傳統(tǒng)的活細(xì)胞成像方法主要是通過(guò)在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染熒光蛋白而實(shí)現(xiàn)。相比之下，有機(jī)染料比熒光蛋白更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗鼈兡墚a(chǎn)生比熒光蛋白高幾個(gè)數(shù)量級(jí)的光子，從而在成像時(shí)能達(dá)到更好的分辨率。但是，能和 STED 成像匹配的活細(xì)胞有機(jī)染料并不多，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的有機(jī)染料都不能透過(guò)細(xì)胞膜和活細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合。    

SiR 染料 (硅羅丹明) 的發(fā)現(xiàn)使 STED 活細(xì)胞成像向前推進(jìn)了一大步。這種染料可輕松穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，并且熒光亮度和穩(wěn)定性都非常好。SiR的化學(xué)結(jié)構(gòu)和光譜性能如圖2，激發(fā)峰在 650 nm, 使用 775 nm 波長(zhǎng)作為損耗光即可做 STED 成像。因?yàn)榫邆浣�紅外染料的特性，SiR染色可以在更低的損耗激光能量之下得到更好的分辨率。目前，市場(chǎng)上已經(jīng)有商品化的 SiR-Tubulin 和 SiR-actin, 直接加入活細(xì)胞中，就可以實(shí)時(shí)采集到細(xì)胞內(nèi)微絲和微管的超高分辨率圖像。
 

▲ 圖 2. SiR的化學(xué)結(jié)構(gòu)和光

雙色超高分辨率成像標(biāo)記

這樣僅是較好的解決了單色活細(xì)胞 STED 成像的問(wèn)題。如果需要跟蹤活細(xì)胞內(nèi)多種組分的變化及其相互作用就需要面臨多色標(biāo)記的困難。SNAP-TAG 和 HALO-TAG 的方法很好的解決了這個(gè)問(wèn)題。

SNAP-TAG 是一種經(jīng)過(guò)改造后的DNA修復(fù)酶，可以特異性和它的底物BG (benzyl guanine芐基鳥(niǎo)嘌呤) 結(jié)合，如果將這種DNA修復(fù)酶的基因和目標(biāo)蛋白的基因融合并轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi)，那么在細(xì)胞內(nèi)加入標(biāo)記了熒光的底物就可以看到細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白的熒光。HALO-TAG也是類(lèi)似的原理，只不過(guò)HALO-TAG的底物是CA (chloroalkane 氯烷烴)。
 

▲ 圖 3. SNAP-TAG示意圖

研究者們通過(guò)這種標(biāo)記工具SNAP-TAG -SiR和HALO-TAG-ATTO590分別標(biāo)記活細(xì)胞中的線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并使用超高分辨顯微鏡（STED）觀(guān)察了這兩種細(xì)胞器中不同蛋白的相互關(guān)系和動(dòng)態(tài)變化（如下圖4），2秒/張的頻率拍攝100張圖片后，熒光亮度仍然保持不變�？梢杂^(guān)察到線(xiàn)粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)融合的整個(gè)過(guò)程，如視頻1和視頻2。
 

▲ 圖 4. STED納米顯微鏡下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線(xiàn)粒體的相互關(guān)系 

視頻  內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管收縮可能形成線(xiàn)粒體的動(dòng)態(tài)過(guò)程，Scale bar = 500 nm

優(yōu)勢(shì)

首先，SNAP-TAG -SiR和HALO-TAG-ATTO590雙色活細(xì)胞標(biāo)記系統(tǒng)亮度高、光穩(wěn)定性好，容易透過(guò)細(xì)胞膜在不影響細(xì)胞正常生理狀態(tài)的前提下進(jìn)行SiR和ATTO590雙色標(biāo)記；其次，這兩個(gè)染料可以用相同的損耗激光采集STED圖像，大大加快了圖像的采集速度，能夠完全滿(mǎn)足多色、快速、活細(xì)胞動(dòng)態(tài)超高分辨率成像的要求。

近幾年來(lái)，隨著STED技術(shù)的發(fā)展，科學(xué)工作者也不斷開(kāi)發(fā)出可以用于STED活細(xì)胞成像的染料和熒光蛋白，相信在不久的將來(lái)會(huì)有更多的活細(xì)胞STED標(biāo)記工具供研究者選擇，并達(dá)到更高的分辨率，得到超越前人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)STED成像領(lǐng)域的更大突破。

參考文獻(xiàn)：

Francesca B., Emil B. K., Edward S. A., et al. Two-colour live-cell nanoscale imaging of intracellular targets. Nat. Commun. 7: 10778 (2016).