細胞呼吸RC與RR可預(yù)測癌癥抑制性藥物的敏感性

參考文獻：Teh JT, Zhu WL, Newgard CB, Casey PJ, Wang M (2019) Respiratory capacity and reserve predict cell sensitivity to mitochondria inhibitors: mechanism-based markers to identify metformin-responsive cancers. Mol Cancer Ther 18:693-705.

  二甲雙胍已被廣泛應(yīng)用于癌細胞代謝和抗癌潛力的研究。盡管有證據(jù)表明服用二甲雙胍的糖尿病患者的癌癥發(fā)生率顯著降低，但該藥物的II期癌癥試驗未能達到理想效果，很可能是因為缺乏基于分子機制的實驗基礎(chǔ)。。為了驗證二甲雙胍對癌癥有抑制作用，新加坡國立大學(xué)在基因敲除和藥理學(xué)抑制電子傳遞鏈組分來降低呼吸能力的研究中，發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸能力和能量儲備能力（在癌細胞中差異很大）與體外及體內(nèi)的二甲雙胍抑制癌細胞生長的敏感性密切相關(guān)。，研究者將實驗研究擴展到22個不同組織來源的癌細胞系，包括肺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、皮膚癌和卵巢癌細胞。這些癌癥細胞系對二甲雙胍抑制增殖表現(xiàn)出廣泛的敏感性（35倍），并且它們的敏感性似乎與組織來源無關(guān)。這些數(shù)據(jù)證實了二甲雙胍的癌細胞生長抑制作用與癌細胞自身的最大呼吸能力和能量儲備能力具有一定的相關(guān)性。
實驗一：該實驗通過測量22種人體癌細胞系發(fā)現(xiàn)，細胞最大呼吸能力和細胞儲備能力與二甲雙胍的癌癥抑制作用具有相關(guān)性

  細胞基礎(chǔ)呼吸水平代表了一定條件下細胞的呼吸水平，但是不能表明細胞應(yīng)對一定壓力或者應(yīng)激的能力。而細胞最大呼吸能力（Max.resp.capacity RC）和細胞儲備能力（Respiratory reserve RR）則表現(xiàn)了細胞能夠承受刺激和應(yīng)對外界壓力的特性。研究者對22種人體癌細胞系的RR與RC分別進行的監(jiān)測，并加入二甲雙胍觀察期間癌細胞的生長情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RR和RC能力較強的癌細胞，其二甲雙胍的抑制作用降低；而RR/RC能力較弱的癌細胞，其二甲雙胍的抑制作用較強。說明癌細胞RR/RC的能力與二甲雙胍的抑制作用有較高的相關(guān)性。 圖1：細胞最大呼吸能力和細胞儲備能力與二甲雙胍對癌細胞生長抑制作用具有較高的相關(guān)性（R2=0.601和R2=0.669），如圖A、圖B；而細胞的基礎(chǔ)呼吸代謝與二甲雙胍對癌細胞的抑制作用的相關(guān)性較低（R2=0.216），如圖C。

實驗二：取生物體內(nèi)癌細胞組織樣本，監(jiān)測其RR/RC的呼吸能力，并同時觀測二甲雙胍對癌細胞生長抑制作用，實驗證明生物體內(nèi)的這種相關(guān)性與體外實驗具有高度一致性

  上文中，研究者發(fā)現(xiàn)在體外癌細胞系中，二甲雙胍的癌細胞抑制作用與癌細胞自身的RR/RC的能力之間具有一定的相關(guān)性；那么，另一點非常重要的是，在生物體內(nèi)是否仍然具有相關(guān)性呢？研究者取活體動物腫瘤組織的癌細胞（來自與體外相同的癌細胞系的），進行呼吸代謝測量與細胞組織培養(yǎng)等研究。發(fā)現(xiàn)活體動物的癌細胞RR/RC的能力與二甲雙胍對癌細胞的抑制作用相關(guān)性非常高，R2值分別為0.844和0.942。隨后研究者測試了在異種移植小鼠中的二甲雙胍抑制性與RR/RC的相關(guān)性。研究者選擇了H1299和MiaPaCa2兩種癌細胞系，這兩種癌癥在體外測試中相同的RR/RC能力對二甲雙胍的抑制敏感性差異較大。在體內(nèi)實驗中發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍對源自MiaPaCa2的癌細胞的生長抑制比較明顯，但對相同方法治療的源自H1299的癌細胞抑制作用不明顯，這與體外測量的結(jié)果相同。因此，這些研究表明，二甲雙胍治療癌癥的功效可從開始治療前的腫瘤組織RR/RC的評估中預(yù)測。

圖2：利用異種移植腫瘤樣品技術(shù)，來研究體內(nèi)癌細胞的呼吸特性和二甲雙胍癌細胞生長抑制作用之間的相關(guān)性。A圖表示異種移植癌細胞組織的呼吸測量方法和測量流程，以及對癌細胞的最大呼吸能力的測量。圖B，異種移植癌細胞與體外相同癌細胞系的最大呼吸能力的相關(guān)性，二者相關(guān)性較高（R2=0.844）；圖C，異種移植癌細胞與體外相同癌細胞系的能量儲備能力相關(guān)性較高（R2=0.942）；圖D和E，分別測量來自MiaPaCa2和H1299的異種移植癌細胞對于二甲雙胍癌細胞抑制作用的敏感性，與對照組相比，二甲雙胍對MiaPaCa2異種移植癌細胞的生長抑制作用較明顯，而對H1299異種移植癌細胞的生長抑制作用幾乎沒有效果。這與體外實驗的結(jié)果相一致

實驗三、應(yīng)用基因敲除技術(shù)和藥理學(xué)技術(shù)降低癌細胞的RR/RC能力，二甲雙胍的抑制癌細胞生長的能力顯著增強

  了解了癌細胞的RR/RC能力與二甲雙胍的抑制性具有直接關(guān)聯(lián)，那么即可通過降低癌細胞的RR/RC，使得二甲雙胍的抑制能力得到提高。為此，研究者通過使用shRNA的低病毒滴度方法，實現(xiàn)了對基因敲除，降低了H1299癌細胞中復(fù)合物I蛋白NDUFAF7的表達，致使癌細胞的RR/RC的降低。將二甲雙胍作用于基因敲除后的癌細胞，發(fā)現(xiàn)癌細胞的生長明顯低于正常癌細胞。同理，使用基因敲除方法降低了復(fù)合物III蛋白UQCRFS1的表達，二甲雙胍的抑制作用明顯增強。

  除了應(yīng)用基因敲除技術(shù)，使電子傳遞鏈的蛋白復(fù)合物表達降低來導(dǎo)致癌細胞的RR/RC能力降低外，研究者還通過藥理學(xué)方法降低了癌細胞的RR/RC能力。魚藤酮可阻斷氧化磷酸化過程中的電子傳遞，進而導(dǎo)致細胞的呼吸能力降低。經(jīng)魚藤酮處理的H1299癌細胞表現(xiàn)出對二甲雙胍抑制作用更加敏感�？傊�，無論是基因敲除技術(shù)還是藥理學(xué)方法，降低了癌細胞的RR/RC能力，二甲雙胍對癌細胞生長的抑制作用將得到增強 圖3. 利用基因敲除技術(shù)，分別降低了電子傳遞鏈上兩個蛋白復(fù)合物上的表達，A圖可見不同劑量的基因敲除技術(shù)中，以sh-Scramble為對照組，隨著sh-NDUFAF7的表達量減少，癌細胞的最大呼吸能力和能量儲備能力均降低，加入二甲雙胍后，圖B可見癌細胞因sh-NDUFAF7的表達減少，引起RR/RC能力降低，導(dǎo)致癌細胞的生長能力下降；同理，基因敲除技術(shù)影響sh-UQCRFS1蛋白的表達（圖C、圖D），其結(jié)果與圖A&B結(jié)果一致。圖E、F為藥物魚藤酮減小細胞的RR/RC能力，隨著魚藤酮含量的增加，二甲雙胍對細胞的生長抑制能力增強。

實驗四、實驗通過惡性轉(zhuǎn)化將正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┌Y細胞，發(fā)現(xiàn)癌癥細胞的RR/RC能力變低，實驗證明RR/RC能力越低，二甲雙胍對癌細胞的生長抑制能力越強。

  實驗通過基因敲除腫瘤抑制因子p53和引入KRAS致癌突變體等方法，將正常人成纖維BJ細胞轉(zhuǎn)化為癌細胞，通過實驗可知癌細胞較正常良性細胞的RR/RC能力降低，實驗證明RR/RC能力越低，二甲雙胍對癌細胞的生長抑制能力越強。

圖4.本實驗中，加入基因敲除腫瘤抑制因子p53和引入KRAS后，圖A可見與對照組相比，p53的表達降低、KRAS的含量增加；圖B中實驗組與對照組相比，其最大呼吸能力與能量儲備能力明顯降低；圖C加入二甲雙胍后，觀察癌細胞的生長情況，實驗組的癌細胞生長情況明顯少于對照組。

  癌細胞在腫瘤發(fā)生過程中改變了其代謝程序。奧地利OROBOROS O2k細胞能量代謝測量與分析系統(tǒng)在腫瘤癌癥等代謝性疾病領(lǐng)域的研究中，為研究癌細胞的生理特性，尋求治療方案等提供理論依據(jù)。以上實驗中的癌細胞的細胞呼吸實驗，是利用OROBOROS O2k細胞能量代謝分析儀完成的。通過實驗獲得細胞最大呼吸能力（Max.resp.capacity RC）和能量儲備能力（RR），為科研工作者在該實驗中提供的必要的數(shù)據(jù)支持，并未臨床靶向治療提供了新的依據(jù)。