全景組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)技術(shù)在新冠肺炎相關(guān)方向研究

TissueFAXS Cytometry技術(shù)在新冠肺炎相關(guān)方向研究

2月17日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院新冠肺炎病因診斷專(zhuān)家組踏上征程。該專(zhuān)家組由國(guó)家衛(wèi)健委委派，赴武漢開(kāi)展新冠肺炎病理學(xué)和病因診斷研究工作。他們的主要任務(wù)是進(jìn)行新冠肺炎病例的病因分析，深入研究疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理過(guò)程，并為后續(xù)研究提供重要科學(xué)支撐。與此同時(shí)，全國(guó)首批新冠肺炎逝者遺體解剖也已在武漢金銀潭醫(yī)院完成。

為什么病理學(xué)信息至關(guān)重要？

目前，臨床上對(duì)于新冠肺炎的了解和認(rèn)知大都來(lái)源于臨床癥狀、影像學(xué)、檢驗(yàn)分析、病毒分析等方面研究。但要真正直觀(guān)地了解器官的損傷、如何損傷、體內(nèi)器官損傷如何相互關(guān)聯(lián)影響等問(wèn)題，都需要通過(guò)病理學(xué)信息來(lái)解決。

病理學(xué)家指出，「對(duì)于新冠肺炎而言，通過(guò)病理解剖研究疾病發(fā)生機(jī)理，有助于幫助臨床糾正可能的錯(cuò)誤診療方案。此外，超微結(jié)構(gòu)、分子病理等方面研究也可以幫助其他領(lǐng)域的專(zhuān)家做很多事情�！�

COVID-19患者的病理學(xué)特征 SARS-CoV-2感染患者的雙肺、肝臟及心臟組織病理標(biāo)本（Zhe Xu, Lei Shi, Yinjin Wang.etal. Pathological findings of COVID-19 associated with acuterespiratory distresssyndrome. Lancet Respir Med 2020）

根據(jù)解剖完成的肺組織切片鏡下可見(jiàn)，COVID-19的患者存在彌漫性的肺泡損傷，伴有支氣管上皮剝脫、纖毛脫落、鱗狀上皮化生等病變；以及肺泡壁大量的炎性滲出，導(dǎo)致患者呼吸困難、血氧含量降低。死者大部分肺泡和肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡上皮細(xì)胞增生，形成雙嗜性胞漿豐富的多核巨細(xì)胞。

病理學(xué)信息是重大疾病確診的最終診斷標(biāo)準(zhǔn)，組織圖像中細(xì)胞不是獨(dú)立存在的，而是交織、混雜在一起，同種細(xì)胞形態(tài)上有時(shí)也會(huì)存在較大差異，要想做到組織圖像中每個(gè)單細(xì)胞標(biāo)記marker的準(zhǔn)確量化、準(zhǔn)確的單細(xì)胞識(shí)別是后續(xù)量化的基礎(chǔ)。TissueFAXS Cytometry專(zhuān)利的單細(xì)胞識(shí)別技術(shù)，可以做到組織內(nèi)不同大小、染色強(qiáng)度、形態(tài)等差異性非常大的細(xì)胞核、質(zhì)、膜多組分準(zhǔn)確識(shí)別，保證細(xì)胞統(tǒng)計(jì)準(zhǔn)確性，為后續(xù)量化分析奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

TG & COVID-19

奧地利TissueGnostics公司的TissueFAXS Cytometry專(zhuān)利技術(shù)是一種基于全景組織細(xì)胞定量分析系統(tǒng)的圖像處理的病理定量分析技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)包括超大尺寸病理切片全景掃描和細(xì)胞培養(yǎng)樣本的數(shù)字化全息獲�。粡膩喖�(xì)胞到組織水平的大數(shù)據(jù)定量分析；目標(biāo)細(xì)胞/組織/結(jié)構(gòu)空間分布水平數(shù)字化定量以及完成從體視學(xué)到大數(shù)據(jù)的雙向獨(dú)立、可重復(fù)的驗(yàn)證。 針對(duì)新冠肺炎的研究，TissueFAXS Cytometry技術(shù)具有極大的應(yīng)用意義。
 

1. HE／IHC樣本組織：自動(dòng)對(duì)簡(jiǎn)單HE染色下肺組織中所有細(xì)胞輪廓進(jìn)行識(shí)別，結(jié)合自動(dòng)肺泡/支氣管的組織識(shí)別功能，迅速判斷炎性細(xì)胞數(shù)量、浸潤(rùn)程度、上皮脫落面積、纖維化程度等指標(biāo)。
2. IF樣本組織：結(jié)合標(biāo)記特異性蛋白Marker的免疫組化或免疫熒光技術(shù)，可以更進(jìn)一步研究肺組織微環(huán)境中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞表型、上皮細(xì)胞化生程度等實(shí)驗(yàn)室精準(zhǔn)定量指標(biāo)。
3. 病毒原位研究：利用特異性核酸熒光探針以及免疫熒光技術(shù)，共同標(biāo)記病毒相關(guān)蛋白的表面抗原及核酸核心，不但可以從圖像中精準(zhǔn)定量病毒在細(xì)胞內(nèi)外的數(shù)量及位置 — 建立通中過(guò)肉眼可以判斷的病毒載量定量標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)分析病毒的增殖侵襲過(guò)程和組織的相互空間關(guān)系！

TissueFAXS Cytometry技術(shù)相關(guān)案例1

無(wú)標(biāo)記形態(tài)學(xué)識(shí)別及定量分析肺組織中的支氣管/血管/肺泡
 
通過(guò)顏色及形態(tài)學(xué)參數(shù)，在識(shí)別肺泡細(xì)胞/支氣管上皮細(xì)胞/血管內(nèi)皮細(xì)胞/紅細(xì)胞的基礎(chǔ)上，對(duì)無(wú)特殊染色標(biāo)記的肺組織中支氣管、血管、肺泡的數(shù)量/大小/形態(tài)進(jìn)行定量分析。

TissueFAXS Cytometry技術(shù)相關(guān)案例2

HE染色下自動(dòng)識(shí)別并定量肺腫瘤/血管/炎性滲出區(qū)域/正常肺泡區(qū)域 根據(jù)肺部腫瘤、炎性細(xì)胞等組織的顏色及形態(tài)學(xué)特性，對(duì)無(wú)特殊染色標(biāo)記的組織病灶及結(jié)構(gòu)進(jìn)行識(shí)別，并用不同顏色標(biāo)記以便進(jìn)行后續(xù)的定量分析。

TissueFAXS Cytometry技術(shù)支持超大組織樣本切片全景掃描和定量分析，協(xié)助科研工作者們突破從分子水平、細(xì)胞水平、組織水平直至器官水平的數(shù)據(jù)瓶頸，分析不同分子/蛋白在不同組織內(nèi)部及相鄰器官中的數(shù)量、形態(tài)、類(lèi)型、分布等信息，從微米尺度到厘米尺度，真正做到100％還原原始樣本！

TG在病毒分子機(jī)制研究中的應(yīng)用發(fā)表文章節(jié)選

• 流行性感冒和肺炎的分子機(jī)制研究 （日本東北大學(xué)醫(yī)學(xué)研究院）

致死性流感肺炎的嚴(yán)重程度取決于OX40L表達(dá)。由于OX40L能夠與細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞的流感病毒相結(jié)合，流感感染時(shí)通過(guò)增加細(xì)胞數(shù)量以介導(dǎo)上皮修復(fù)，并誘導(dǎo)其表面的OX40L表達(dá)從而刺激免疫反應(yīng)。然而，宿主的防御反應(yīng)將會(huì)導(dǎo)致更廣泛的感染，最終造成過(guò)度的免疫防御反應(yīng)而致死。
F，G： 對(duì)比致死劑量的A / H1N1流感病毒（Flu）和生理鹽水（Mock）氣管內(nèi)感染的WT小鼠肺細(xì)支氣管的免疫熒光樣本，因?yàn)镃CSP（紅色）和SPC（綠色）雙陽(yáng)性表達(dá)被認(rèn)為是細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞的特征，用來(lái)反映支氣管肺泡干細(xì)胞的存在與否。

由TissueFAXS系統(tǒng)掃描的影像數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析得出，甲流病毒的感染使終末細(xì)支氣管CCSP免疫反應(yīng)性細(xì)胞的脫落，但CCSP/SPC雙陽(yáng)性細(xì)胞則更多的在遠(yuǎn)端支氣管部位出現(xiàn)，修復(fù)受損的上皮。

• AXL受體-星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)研究（上海復(fù)旦大學(xué)附屬金山公共衛(wèi)生臨床中心）

​ 細(xì)胞膜表面分子AXL在寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）染星形膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程中扮演著重要角色，但它并不是ZIKV進(jìn)入星形膠質(zhì)細(xì)胞的主要受體，AXL分子主要通過(guò)STAT1/STAT2通路調(diào)控SOCS1分子表達(dá)，進(jìn)而抑制I型干擾素信號(hào)應(yīng)答，最終促進(jìn)ZIKV在宿主細(xì)胞中復(fù)制。該研究發(fā)現(xiàn)的ZIKV感染神經(jīng)細(xì)胞的新機(jī)制，為研發(fā)新型有效的ZIKV防御技術(shù)提供了生物學(xué)新靶點(diǎn)。 b,c：ISH法檢測(cè)ZIKV RNA，并對(duì)內(nèi)部的ZIKV RNA進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析g,h：AXL基因敲除介導(dǎo)的ZIKV復(fù)制能力受到IFNAR1信號(hào)通路控制，IFNAR信號(hào)依賴(lài)機(jī)制可以有效保護(hù)星形膠質(zhì)細(xì)胞

病毒分離鑒定十分復(fù)雜，利用StrataQuest軟件對(duì)免疫熒光、原位雜交的掃描圖像進(jìn)行分析，獨(dú)有的細(xì)胞質(zhì)形態(tài)識(shí)別功能，可以十分清晰的看到病毒的復(fù)制數(shù)量、作用靶點(diǎn)以及空間分布位置，為明確病毒感染細(xì)胞的作用機(jī)制提供有效的幫助。

• HIV/SIV及結(jié)核病的相關(guān)性研究（美國(guó)麻省理工學(xué)院，哈佛醫(yī)學(xué)院）

研究人員對(duì)人肺組織、人源化小鼠CD4+T細(xì)胞以及結(jié)核分枝桿菌（Mtb）/ 猴免疫缺陷病毒（SIV）非人靈長(zhǎng)類(lèi)共感染模型中的感染情況進(jìn)行研究，表明肺實(shí)質(zhì)CD4+T細(xì)胞對(duì)HIV-1依賴(lài)性細(xì)胞死亡具有耐受性，而CD4+T細(xì)胞在肺間質(zhì)而不是肺泡腔中的缺失非常顯著，CD4+T細(xì)胞的缺失與肺外播散有關(guān)，研究還證明了肺間質(zhì)CD4+T細(xì)胞是HIV-1和SIV感染的有效靶點(diǎn)，使得其早期衰竭缺失和播散性肺結(jié)核的風(fēng)險(xiǎn)增加。 實(shí)驗(yàn)人員對(duì)肺部及脾臟組織的CD4+T IHC切片進(jìn)行組織原位掃描明確感染部位及CD4+的分布情況并對(duì)CD4+細(xì)胞進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)CD4 + T細(xì)胞高度允許HIV-1誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡而HIV-1感染不會(huì)明顯改變肺泡CD4 + T細(xì)胞數(shù)量。但是，SIV感染導(dǎo)致肺結(jié)核期間間質(zhì)CD4 +T細(xì)胞耗竭并進(jìn)一步證實(shí)出肺間質(zhì)CD4 + T細(xì)胞丟失與播散性結(jié)核有關(guān)。

嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)研究需要客觀(guān)、量化的數(shù)據(jù)支持，針對(duì)于肺部等組織免疫細(xì)胞的數(shù)量關(guān)系、空間位置分布情況以及相互作用關(guān)系，TissueFAXS Cytometry技術(shù)可以提供組織原位精準(zhǔn)定量的數(shù)據(jù)結(jié)果，將極大的推動(dòng)研究者們的科研進(jìn)展。