新時代下對于Western Blotting發(fā)表文章的新要求（二）

 

上一期我們聊了期刊雜志的新要求，總結(jié)如下：
 

▶  不建議跑平行膠，因為平行膠和剝離膜，孵育體系，操作條件的不一致，影響定量的準(zhǔn)確性，因此最好內(nèi)參和目的蛋白要在同一張印跡膜上。

▶  選擇寬動態(tài)范圍的方法，確認信號強度與所上樣量之間的線性關(guān)系，例如用膠片做化學(xué)發(fā)光方法的動態(tài)范圍就很窄，不建議使用。

▶  強烈推薦使用總蛋白進行歸一化，因為看家蛋白容易受處理條件影響而發(fā)生變化，影響定量的結(jié)果，使用總蛋白定量更真實地反映目標(biāo)蛋白表達量的變化。

▶  提交原始數(shù)據(jù)，例如：JBC，PLOS和CELL等雜志都要求要提供原始數(shù)據(jù)。
 

Azure公司除了有Sapphire雙模式多光譜激光成像系統(tǒng)可滿足需求， Azure600多功能分子成像系統(tǒng)也可幫助您獲得期刊雜志要求的Western Blot數(shù)據(jù)：

 

 

▶ Azure600標(biāo)配有5個熒光光源，可同時在一張印跡膜上進行4通道熒光成像 ，同時也具有高靈敏化學(xué)發(fā)光檢測功能，靈敏度可達fg級

 

熒光Western Blot使用熒光基團標(biāo)記的二抗進行檢測，膜上的靶標(biāo)蛋白濃度與可見熒光信號強度呈線性關(guān)系，實現(xiàn)真實可靠的定量分析。熒光染料發(fā)射光譜不同，因此在一張印跡膜上可實現(xiàn)多個蛋白檢測。這樣目標(biāo)蛋白和內(nèi)參蛋白在同一張膜上，可以避免數(shù)據(jù)造假的情況發(fā)生，更容易被期刊雜志接收。

 

 

圖1：通過使用四種光譜不同熒光基團標(biāo)記的二抗，可以同時檢測多達四種不同的蛋白。HeLa細胞裂解物上樣，Anti-Tubulin (550nm, 綠色), Anti-Actin (700nm紅色), Anti-GAPDH (800nm, 灰色),和Anti-Transferrin (490nm, 藍色)這四種蛋白同時成像，沒有交叉。

 

▶ Azure600近紅外采用激光光源， 激發(fā)強度大，單色性好，減少光泄漏，在更短的時間內(nèi)達到更好的信噪比，Western Blot精準(zhǔn)定量的金標(biāo)準(zhǔn)
 

 

▶ Azure600配合AzureRed總蛋白熒光染色劑可以做總蛋白歸一化和定量三個靶標(biāo)蛋白，生成可以信賴的定量Western Blot數(shù)據(jù)

 

使用總蛋白歸一化，以校正泳道和樣品之間的差異。傳統(tǒng)的方法無法準(zhǔn)確知道條帶灰度值和強度的變化是由于樣品的生物學(xué)變化引起的，還是由于上樣不一致性或樣品制備的差異引起的。總蛋白定量的優(yōu)勢如下：
 

★ 總蛋白比看家基因等內(nèi)參的線性檢測范圍更寬；

★ 在整個實驗和系統(tǒng)中更加穩(wěn)定；

★ 能有效排除實驗條件和體系對結(jié)果的影響；

★ 更真實地反映目標(biāo)蛋白表達量的變化。

 

圖2.總蛋白歸一化和定量三個靶標(biāo)蛋白. Tubulin 紅色通道, Actin 藍色通道,GAPDH綠色通道, AzureRed/Total protein 用灰色表示
 

圖3.使用總蛋白對Tubulin信號進行歸一化糾正上樣誤差

 

▶Azure600標(biāo)配9.1MP的高分辨CCD，動態(tài)范圍可達4.8OD，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性
 

圖4.過飽和檢測可防止定量誤差，相同的印跡膜分別使用膠片成像和Azure成像系統(tǒng)，Azure成像系統(tǒng)具有過飽和提醒，自動計算曝光時間以避免飽和

 

▶ Azure600可做彩色Marker與化學(xué)發(fā)光條帶的自動整合，分子量查看更直觀
 

 

▶ Azure600提供原始數(shù)據(jù)16bit的tiff圖給到期刊，這里的tiff原始數(shù)據(jù)是指未經(jīng)裁剪，像素修改，對比度調(diào)整等任何操作的圖，保證結(jié)果的真實性和可靠性

 

Azure600除了進行熒光印跡膜，化學(xué)發(fā)光印跡膜檢測外，還可以進行普通凝膠成像，EMSA檢測，菌落篩選，小動物成像，植物成像等。

 

 

想試用Azure600多功能分子成像系統(tǒng)，請咨詢北京深藍云生物科技公司。

電話：010-57256059