PCR檢測難點與解決方案

 
我太“南”了
 
PCR算是實驗室最磨練耐心的實驗之一了，好不容易完成了樣品準備、核酸的提取，然而PCR之后沒有產(chǎn)物，是漏加了試劑，還是酶失活？換上新試劑，格外小心，重來一次，沒用�。�，依然P不出條帶。內心無比凄涼，悲傷逆流成河。
 
本來做個PCR研究都夠難了，現(xiàn)在還偏要碰到“困難模板”，小白不哭，沒有條帶不要著急，學姐總結經(jīng)驗，帶你攻克各路PCR困難模板。
 
高GC含量模板

難點
DNA序列中，G-C之間的三對氫鍵通常需要較高能量解鏈，模板很難打開，易形成復雜的二級結構，DNA聚合酶難以推進。因此高GC含量（G+C>=60%）DNA序列在常規(guī)PCR條件下比較難擴增。
解決方案

• 選用專門針對GC-RICH PCR系統(tǒng)試劑盒：
  包含高合成能力的DNA聚合酶，這類酶對DNA模板的親和力較高，更適合擴增困難靶標
• 添加1~2M betaine：
  betaine在PCR混合液里可以保護DNA聚合酶免被高溫變性傷害，還能促進DNA-蛋白質復合物的穩(wěn)定，提高擴增效率。
• 添加2~5% DMSO：
  DMSO可以降低DNA的二級結構。但DMSO也會降低Taq polymerase的活性，因此DMSO的使用濃度需要優(yōu)化。

 
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D8418	DMSO for molecular biology	<<<點擊查看>>>

 
 
長片段模板

難點
長片段DNA序列在PCR過程中易損傷，使其斷裂或脫嘌呤，導致長片段PCR無法進行。Taq酶具有一定的錯配率，導致產(chǎn)物鏈3‘端出現(xiàn)錯配堿基，鏈合成提前終止。非特異性擴增也會干擾長片段的延伸。
解決方案

• 使用專為長片段PCR設計的PCR系統(tǒng)試劑盒：包含兼具矯正功能的DNA酶和高合成能力的DNA聚合酶，這類酶能夠在短時間內擴增長片段。
• 設計較長的長片段PCR引物（21~34bp），提高反應特異性，減少錯配率。
• 適當降低延伸溫度，同時根據(jù)模板長度加長延伸反應時間（通常1kb/min）。
• 緩沖液體系需提高Tris的濃度或改用Tricine緩沖液以增強緩沖能力，使緩沖液的pH不會降的過低而影響酶活性。

 
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低純度模板

難點
低純度模板中可能含有PCR抑制劑殘留，如蛋白酶K、苯酚和EDTA；殘留的鹽分或離子，如K⁺，Na⁺等也可能會抑制DNA聚合酶，從而影響PCR擴增。
解決方案

• 選擇合成能力高，對抑制劑耐受力高的DNA聚合酶，比如，把野生型Ta酶通過Directed Evolution工程化修飾的KAPA2G DNA聚合酶。
• 使用70%乙醇再純化DNA，去除殘留鹽分或離子。
• 把模板適度稀釋，再加入反應體系中，減少抑制物的影響。
• 若存在EDTA或其它金屬螯合劑時，需要適當提高能與EDTA結合的 Mg2+濃度。

 

貨號	產(chǎn)品描述
KK5024	KAPA2G Robust PCR Kit	<<<點擊查看>>>
KK7252	KAPA3G Plant PCR Kit	<<<點擊查看>>>
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低濃度模板

難點
模板濃度是決定Ct的最主要因素，需控制在一個合適范圍內，使Ct在15-35之間。低濃度模板不僅會影響PCR效率降低得率，甚至無擴增產(chǎn)物。
解決方案

• 選擇高靈敏度，高合成能力的DNA聚合酶。
• 避免樣制備中雜質的引入及反復凍融的情況。
• 再次擴增PCR產(chǎn)物，得到更高的目標DNA得率。
• PCR擴增無產(chǎn)物時，可以適當提高Mg2+濃度（終濃度范圍：1~4 mM）。

 
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