Western Blot實驗操作中的縮短數(shù)據(jù)差異的應對方法

做Western Blot的小伙伴，你是不是還在那里熬夜趕實驗？是不是還在糾結今天的結果怎么和昨天的差異這么大？是不是在為選擇哪種檢測方法而煩惱？在為實驗的重復性而抓狂？今天小編就和大家聊一下Western Blot中遇到的問題以及應對方法。

歸一化問題：

做Western Blot經(jīng)常需要對蛋白進行歸一化，經(jīng)典的歸一化方法是看家蛋白歸一化，看家蛋白需要選擇在不同樣品間穩(wěn)定表達的蛋白；其次表達豐度也需要篩選，如果豐度過高，目的蛋白豐度與看家蛋白差異過大，那兩者檢測定量時就不在一個線性范圍。這樣的篩選過程非常耗時耗力。即使篩選到合適的看家蛋白，對其歸一化的過程也需要多次重復調節(jié)才可以。

檢測靈敏度問題：

小編做Western Blot檢測時，由于目的蛋白含量低經(jīng)常曝光不出來，同時老儀器檢測靈敏度不夠高，只能不斷調整實驗，提高上樣量，再反復進行摸索，做Western 做到懷疑人生。

蛋白定量重復性問題：

Western Blot檢測時，化學發(fā)光依賴酶活性和底物濃度，發(fā)光信號不穩(wěn)定，因此定量時容易出現(xiàn)誤差，重復性相對較差，也只能不斷實驗來進行調整和驗證。

多個目的蛋白檢測問題：

Western Blot檢測時，有時需要對多個蛋白進行檢測，這時的實驗就會變的繁瑣，需要對每一個蛋白進行表達檢測，剪膜，剝離膜經(jīng)常要做，但是經(jīng)過這些步驟又會影響定量的精準性，小編也很為難。

那么上述問題有沒有好的解決方法呢？這里悄悄告訴大家一個好消息，采用Sapphire雙模式多光譜成像系統(tǒng)，可以很好的解決上述困擾，好文章也在向你招手。

Sapphire成像系統(tǒng)采用雙模式，既有掃描式又有CCD成像式；多達四激光激發(fā)用于熒光成像，每個通道配有自己獨立的檢測器，PMT檢測器用于藍光成像，3個APD檢測分別用于綠光、紅光和近紅外檢測，高分辨率CCD用于化學發(fā)光檢測，在全光譜范圍內避免信號損失；動態(tài)范圍可達6log；軟件操作簡單，易于上手。

應對均一化問題，已有眾多期刊建議采用總蛋白均一化，總蛋白均一化能夠更加真實的反應目的蛋白表達量的變化，同時也無需繁瑣的篩選看家蛋白、調整蛋白上樣，只需對總蛋白進行染色和調整，Azure提供總蛋白歸一化試劑和相應的AzureSpot分析軟件，輕松搞定蛋白均一化問題 。

應對低豐度蛋白檢測問題，Sapphire雙模式多光譜成像系統(tǒng)可以加配610萬像素，大光圈的優(yōu)質CCD檢測器，其檢測靈敏度可以達到fg級，動態(tài)范圍是傳統(tǒng)膠片的4倍�？梢赃M行累積曝光，可以快速得到你需要的圖像，無需多次重復和改變上樣。

應對重復性問題，熒光檢測方法與傳統(tǒng)的化學發(fā)光不同，熒光檢測方法不依賴酶活性和底物，二抗標記熒光基團，信號強度和上樣量成線性關系，信號持久，可以得到更好的重復性結果，實驗可以快速完成。

應對多種蛋白檢測問題，熒光檢測的一個好處是，無需剝離和重孵育，即可在一張印跡膜上進行多種蛋白的檢測，減少蛋白變化的誤差，實現(xiàn)精準定量。

Azure Sapphire雙模式成像系統(tǒng)

無需再為Western實驗所累