MSC來(lái)源的外泌體對(duì)骨折愈合的作用

據(jù)估計(jì)，美國(guó)每年大約有1500萬(wàn)新發(fā)生的骨折患者，主要是由車(chē)禍、運(yùn)動(dòng)傷害或工作事故引起。相當(dāng)一部分的患者（10-15%）會(huì)發(fā)生延遲愈合或不愈合，這需要延長(zhǎng)治療或重復(fù)治療，對(duì)治療成本和生活質(zhì)量都有很大影響。骨折的修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，需要利用內(nèi)源性的細(xì)胞再生潛力來(lái)恢復(fù)原始的骨骼結(jié)構(gòu)。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的移植已經(jīng)在一些疾病模型中顯示出治療效果，包括在穩(wěn)定的骨折模型中促進(jìn)成骨和血管生成。不過(guò)，將MSC直接移植到目標(biāo)組織，仍然存在局限和挑戰(zhàn)。比如，在缺血組織中，移植的干細(xì)胞存活率極低。此外，其他相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)也限制了移植MSC在臨床上幫助骨折愈合，包括免疫排斥、細(xì)胞去分化和腫瘤形成。最近的研究表明，旁分泌機(jī)制可能參與了MSC在治療多種疾病中的作用，而外泌體（exosomes）可能在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

研究已經(jīng)證實(shí)，外泌體移植表現(xiàn)出的治療效果與直接移植的干細(xì)胞相似，但不良反應(yīng)要少得多。之前的一項(xiàng)研究表明，在心肌梗死模型中，MSC來(lái)源的外泌體可促進(jìn)血管生成。此外，MSC的低氧預(yù)處理可以明顯增加其生物學(xué)功能和活性，從而提高M(jìn)SC在各種疾病模型中的移植效力。不過(guò)，目前還不清楚低氧條件下的MSC是否能促進(jìn)骨折愈合，以及這種增強(qiáng)是否通過(guò)外泌體信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)介導(dǎo)。

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的研究人員在《Acta Biomaterialia》雜志上發(fā)表文章，揭示了低氧條件下間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體通過(guò)轉(zhuǎn)移miR-126而促進(jìn)骨折愈合。這些結(jié)果表明，低氧預(yù)處理可作為一種有效的方法，來(lái)優(yōu)化MSC來(lái)源的外泌體對(duì)骨折愈合的治療作用。

低氧促進(jìn)外泌體的釋放

研究人員從人類(lèi)臍帶中分離出人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（HucMSC），并分別利用Alizarin Red、Oil Red O和Alcian Blue來(lái)鑒定HucMSC的成骨、成脂和軟骨分化。在此過(guò)程中，他們使用了賽業(yè)生物的OriCell™ 成骨、成脂和軟骨分化培養(yǎng)基。

接下來(lái)，他們確定HucMSC的低氧狀況是否會(huì)影響它們釋放的外泌體。他們?cè)诔Ｑ鹾偷脱酰?%CO2）下分別接種HucMSC，孵育48小時(shí)后從無(wú)血清培養(yǎng)基中分離外泌體，并利用電鏡、納米顆粒追蹤分析（NTA）和western blot進(jìn)行分析。與常氧對(duì)照相比，低氧條件誘導(dǎo)了外泌體釋放的顯著增加。后續(xù)實(shí)驗(yàn)還表明，低氧條件下產(chǎn)生的外泌體更容易被內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC吸收。

Hypo-Exo促進(jìn)血管生成、增殖和遷移

接著，利用小鼠股骨骨折模型，研究人員評(píng)估了Hypo-Exo和Exo對(duì)骨折愈合的作用。他們利用高分辨率micro-CT掃描后發(fā)現(xiàn)，Hypo-Exo的移植可以促進(jìn)骨折愈合。為了進(jìn)一步確定骨折愈合的原因，他們檢測(cè)了成骨相關(guān)基因（ALP、COLA1和OCN）和血管生成相關(guān)基因（VEGF）。結(jié)果表明，Hypo-Exo主要通過(guò)血管生成而促進(jìn)骨折愈合。

為了確定Hypo-Exo在體外是否發(fā)揮相似的治療作用，研究人員利用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）開(kāi)展體外實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞增殖分析表明，與Hypo-Exo共同孵育導(dǎo)致HUVEC的增殖顯著增加。同時(shí)，細(xì)胞遷移分析也表明Hypo-Exo增強(qiáng)了血管形成能力。這些結(jié)果表明，與體外的PBS和Exo處理相比，Hypo-Exo可大大促進(jìn)增殖、遷移和血管形成（圖1）。

圖1. Hypo-Exo在體外促進(jìn)了HUVEC的細(xì)胞增殖、遷移和血管形成

Hypo-Exo中的miR-126上調(diào)

之后，研究人員通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，來(lái)自Hypo-Exo中的miRNA可能發(fā)揮生物學(xué)作用，并最終促進(jìn)骨折愈合。具體是哪個(gè)或哪些miRNA？他們開(kāi)展了miRNA芯片分析，發(fā)現(xiàn)Hypo-Exo組中有94個(gè)miRNA上調(diào)，39個(gè)下調(diào)。其中，miR-126的表達(dá)明顯上調(diào)，且已知其對(duì)血管生成具有積極作用。于是，他們后續(xù)的研究重點(diǎn)放在miR-126上。

研究人員想了解miR-126是否充當(dāng)了低氧MSC與HUVEC之間的生物學(xué)信使，并可以調(diào)節(jié)血管生成。通過(guò)一系列體外和體內(nèi)的功能獲得和功能喪失分析，他們發(fā)現(xiàn)外泌體miR-126的knockdown能夠在體外和體內(nèi)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，表明miR-126在Hypo-Exo介導(dǎo)的血管生成中發(fā)揮重要功能。通過(guò)進(jìn)一步的分析，他們確認(rèn)SPRED1是miR-126的目標(biāo)基因（圖2）。

圖2. miR-126的knockdown在體外和體內(nèi)抑制了Hypo-Exo介導(dǎo)的細(xì)胞增殖、遷移和血管生成

之前的研究表明，低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1α）對(duì)于低氧期間miRNA的表達(dá)至關(guān)重要。因此，研究人員想了解HIF-1α是否調(diào)節(jié)外泌體中的miR-126。通過(guò)轉(zhuǎn)染siRNA，他們發(fā)現(xiàn)HIF-1α的下調(diào)顯著降低了低氧誘導(dǎo)的miR-126表達(dá)。后續(xù)的分析表明，HIF-1α誘導(dǎo)了miR-126的表達(dá)及其在外泌體中的負(fù)荷。

通過(guò)一系列的體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，這項(xiàng)研究證實(shí)了Hypo-Exo通過(guò)外泌體miR-126促進(jìn)骨折愈合的機(jī)制。研究人員認(rèn)為，低氧可能通過(guò)HIF-1α的作用來(lái)介導(dǎo)miR-126的產(chǎn)生。因此，低氧預(yù)處理是一種有效的方法，有望優(yōu)化MSC來(lái)源的外泌體在骨折愈合中的治療作用。