基因擴(kuò)增PCR的擴(kuò)增與克隆方法及一些使用的小建議

基因擴(kuò)增PCR主要有冰箱、超凈臺(tái)、加樣器、混勻器、天平等。加樣器、天平除了要專用外，還應(yīng)有定期校準(zhǔn)。試劑分裝應(yīng)在超凈臺(tái)中進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)混合液應(yīng)使用分子生物學(xué)級(jí)的，試劑制備好后應(yīng)有質(zhì)檢：一是否有污染、二是檢測(cè)試劑的擴(kuò)增效果。
 

基因擴(kuò)增PCR的擴(kuò)增與克隆方法：

　�、僖�物的序列應(yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū)，且與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異性結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性

　�、谝�物長(zhǎng)度：15－40bp為宜。引物過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)均可使反應(yīng)的特異性下降。

　　③引物的堿基盡可能隨機(jī)發(fā)布，避免出現(xiàn)數(shù)個(gè)嘌呤或嘧啶的連續(xù)排列，G+C堿基的含量在40%－75%之間。

　�、芤�物內(nèi)部應(yīng)避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，特別是引物的末端應(yīng)避免有回文結(jié)構(gòu)。

　�、荻�個(gè)引物不應(yīng)有互補(bǔ)序列，特別是3’端應(yīng)避免互補(bǔ)，以免形成“引物二聚體”，浪費(fèi)引物。

　�、抟�物5’末端堿基無(wú)嚴(yán)格限制，在與模板DNA結(jié)合的引物長(zhǎng)度足夠的條件下，其5’端堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)，因此可在引物5’端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)、啟動(dòng)子序列或其它序列等以便于PCR產(chǎn)物的分析克隆等，引物的5’端至多可加10個(gè)堿基而對(duì)PCR反應(yīng)無(wú)影響。

　　基因擴(kuò)增PCR的使用建議：

　　1、使用本制品時(shí)務(wù)必將Buffer反復(fù)混勻后再加，避免因組分不一導(dǎo)致結(jié)果差異；

　　2、配置和分裝反應(yīng)液時(shí)請(qǐng)一定使用新的（無(wú)污染的）噴頭以避免污染；

　　3、如擴(kuò)增條帶多，可適當(dāng)添加酶和dNTPs；

　　4、當(dāng)多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度均在1kb以內(nèi)時(shí)，使用3%～4％濃度的Agarosegel進(jìn)行電泳分離效果。