支原體檢測(cè)步驟
實(shí)驗(yàn)步驟：
a.在檢測(cè)板中加入50μl的檢測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照(如無(wú)菌水或PBS、新鮮培養(yǎng)液)。
b.加入50μl的支原體檢測(cè)試劑A，混勻，20-25℃放置5分鐘。然后用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，即讀值為A。請(qǐng)根據(jù)儀器要求設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，每個(gè)孔的檢測(cè)時(shí)間一般為0.25-1秒或更長(zhǎng)時(shí)間，具體需根據(jù)儀器的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
c.加入50μl的支原體檢測(cè)試劑B，混勻，20-25℃放置10分鐘。然后用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，即讀值為B。注：請(qǐng)嚴(yán)格按照加入支原體檢測(cè)試劑B后10分鐘進(jìn)行檢測(cè)，切勿提前或延后，否則可能會(huì)影響比值在臨界值附近樣品的結(jié)果判斷。
d.計(jì)算比值(Ratio)=讀值B/讀值A(chǔ)。參考表1，比值大于1.2說(shuō)明有支原體污染，比值小于0.9表示沒(méi)有支原體污染，比值在0.9-1.2之間可以將原樣品繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)后重新檢測(cè)。
表1. Myco-Lumi™發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒的結(jié)果分析。
備注1：有些樣品如添加了特殊藥物或使用某些特殊培養(yǎng)液，可能含有抑制或增強(qiáng)反應(yīng)的成分而導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性，此時(shí)可以將樣品稀釋10倍后再進(jìn)行檢測(cè)，并進(jìn)一步根據(jù)稀釋后測(cè)定出來(lái)的B/A比值來(lái)判定是否有支原體污染。
備注2：本試劑盒可以檢測(cè)出常見的44種支原體污染(具體見附錄)，但是不能具體區(qū)分是何種支原體污染。如需鑒定污染支原體種類，請(qǐng)選用支原體PCR檢測(cè)試劑盒(C0301)。
e.本試劑盒用ThermoFisher的多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX檢測(cè)一些常見樣品的示例結(jié)果請(qǐng)參考表2。陽(yáng)性對(duì)照(Positive Control)為試劑盒中提供的陽(yáng)性對(duì)照，常用溶劑(Common Solvents)為超純水(Water)和PBS，常用細(xì)胞培養(yǎng)液(Common Culture Medium)為RPMI-1640和DMEM，陽(yáng)性樣品(Positive Samples)為支原體污染的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清(其中10倍稀釋為按1:9用PBS稀釋)，陰性樣品(Negative Samples)為無(wú)支原體污染的BEAS-2B和293T細(xì)胞培養(yǎng)上清。本試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照，由于反復(fù)凍融導(dǎo)致部分失活等因素，實(shí)際測(cè)定出來(lái)的比值可能會(huì)和表2和圖2中所列數(shù)據(jù)有較明顯的偏差。而超純水、PBS、RPMI-1640和DMEM檢測(cè)出來(lái)的比值數(shù)據(jù)和所列數(shù)據(jù)會(huì)相對(duì)比較接近。實(shí)際測(cè)定出來(lái)的讀值A(chǔ)和B，不同的儀器設(shè)備可能會(huì)有非常大的差別。
表2. Myco-Lumi™發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用)檢測(cè)數(shù)據(jù)示例。注：ThermoFisher的多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX為高靈敏度儀器，所以讀值較高，實(shí)際在低靈敏度儀器中，讀值可能在幾十至上千。
圖2. Myco-Lumi™發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析。實(shí)際讀數(shù)和比值會(huì)因細(xì)胞種類、細(xì)胞培養(yǎng)液、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
.化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或者具有檢測(cè)化學(xué)發(fā)光功能的酶標(biāo)儀、和酶標(biāo)儀配套使用的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)專用的96孔板(白板)。
b.無(wú)菌離心管、槍頭及移液槍。
2.試劑和檢測(cè)樣品準(zhǔn)備：
a.所有試劑使用前要平衡至室溫，最適宜的溫度是20-25℃。
b.檢測(cè)樣品準(zhǔn)備：取0.2-1ml培養(yǎng)3-6天的細(xì)胞上清(培養(yǎng)時(shí)間較短的細(xì)胞上清也可以檢測(cè)，但上清中釋放的支原體較少，檢測(cè)靈敏度會(huì)顯著下降)，200×g (約1500rpm)離心5分鐘以沉淀少量漂浮的細(xì)胞或細(xì)胞碎片，取上清。上清樣品最好收集后立即檢測(cè)，也可以在室溫或4℃放置并當(dāng)天檢測(cè)，或者置于-80℃保存半年內(nèi)檢測(cè)。低溫保存的樣品檢測(cè)的時(shí)候須室溫融化并達(dá)到室溫后才可用于檢測(cè)。
a.在檢測(cè)板中加入50μl的檢測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照(如無(wú)菌水或PBS、新鮮培養(yǎng)液)。
b.加入50μl的支原體檢測(cè)試劑A，混勻，20-25℃放置5分鐘。然后用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，即讀值為A。請(qǐng)根據(jù)儀器要求設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，每個(gè)孔的檢測(cè)時(shí)間一般為0.25-1秒或更長(zhǎng)時(shí)間，具體需根據(jù)儀器的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
c.加入50μl的支原體檢測(cè)試劑B，混勻，20-25℃放置10分鐘。然后用多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，即讀值為B。注：請(qǐng)嚴(yán)格按照加入支原體檢測(cè)試劑B后10分鐘進(jìn)行檢測(cè)，切勿提前或延后，否則可能會(huì)影響比值在臨界值附近樣品的結(jié)果判斷。
d.計(jì)算比值(Ratio)=讀值B/讀值A(chǔ)。參考表1，比值大于1.2說(shuō)明有支原體污染，比值小于0.9表示沒(méi)有支原體污染，比值在0.9-1.2之間可以將原樣品繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)后重新檢測(cè)。
表1. Myco-Lumi™發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒的結(jié)果分析。
| B/A比值 | 結(jié)果分析 | 處理方法 |
| <0.9 | 支原體陰性，無(wú)支原體污染 | 無(wú)需處理，定期檢測(cè) |
| 0.9-1.2 | 臨界值，結(jié)果較可疑 | 樣品隔離培養(yǎng)24~48小時(shí)后再進(jìn)行測(cè)試 |
| >1.2 | 支原體陽(yáng)性，有支原體污染 | 細(xì)胞滅菌處理后丟棄或隔離后用專用的支原體預(yù)防或去除試劑處理 |
備注2：本試劑盒可以檢測(cè)出常見的44種支原體污染(具體見附錄)，但是不能具體區(qū)分是何種支原體污染。如需鑒定污染支原體種類，請(qǐng)選用支原體PCR檢測(cè)試劑盒(C0301)。
e.本試劑盒用ThermoFisher的多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX檢測(cè)一些常見樣品的示例結(jié)果請(qǐng)參考表2。陽(yáng)性對(duì)照(Positive Control)為試劑盒中提供的陽(yáng)性對(duì)照，常用溶劑(Common Solvents)為超純水(Water)和PBS，常用細(xì)胞培養(yǎng)液(Common Culture Medium)為RPMI-1640和DMEM，陽(yáng)性樣品(Positive Samples)為支原體污染的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)上清(其中10倍稀釋為按1:9用PBS稀釋)，陰性樣品(Negative Samples)為無(wú)支原體污染的BEAS-2B和293T細(xì)胞培養(yǎng)上清。本試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照，由于反復(fù)凍融導(dǎo)致部分失活等因素，實(shí)際測(cè)定出來(lái)的比值可能會(huì)和表2和圖2中所列數(shù)據(jù)有較明顯的偏差。而超純水、PBS、RPMI-1640和DMEM檢測(cè)出來(lái)的比值數(shù)據(jù)和所列數(shù)據(jù)會(huì)相對(duì)比較接近。實(shí)際測(cè)定出來(lái)的讀值A(chǔ)和B，不同的儀器設(shè)備可能會(huì)有非常大的差別。
表2. Myco-Lumi™發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用)檢測(cè)數(shù)據(jù)示例。注：ThermoFisher的多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX為高靈敏度儀器，所以讀值較高，實(shí)際在低靈敏度儀器中，讀值可能在幾十至上千。
| 樣品 | 陽(yáng)性對(duì)照 | 常用溶劑 | 常用細(xì)胞培養(yǎng)液 | 陽(yáng)性樣品 | 陰性樣品 | ||||
| C0297S-3/C0297M-3 | 超純水 | PBS | RPMI-1640 | DMEM | HeLa培養(yǎng)上清 | 10倍稀釋 | BEAS-2B培養(yǎng)上清 | 293T培養(yǎng)上清 | |
| 讀值A(chǔ) | 17975 | 26525 | 23925 | 23990 | 24390 | 36685 | 25550 | 24825 | 24960 |
| 讀值B | 197150 | 15865 | 14970 | 15910 | 15630 | 1662000 | 38265 | 16445 | 16760 |
| 比值(B/A) | 10.97 | 0.60 | 0.63 | 0.66 | 0.64 | 4.53 | 1.50 | 0.66 | 0.67 |
圖2. Myco-Lumi™發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(低靈敏度儀器用)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析。實(shí)際讀數(shù)和比值會(huì)因細(xì)胞種類、細(xì)胞培養(yǎng)液、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。.化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或者具有檢測(cè)化學(xué)發(fā)光功能的酶標(biāo)儀、和酶標(biāo)儀配套使用的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)專用的96孔板(白板)。
b.無(wú)菌離心管、槍頭及移液槍。
2.試劑和檢測(cè)樣品準(zhǔn)備：
a.所有試劑使用前要平衡至室溫，最適宜的溫度是20-25℃。
b.檢測(cè)樣品準(zhǔn)備：取0.2-1ml培養(yǎng)3-6天的細(xì)胞上清(培養(yǎng)時(shí)間較短的細(xì)胞上清也可以檢測(cè)，但上清中釋放的支原體較少，檢測(cè)靈敏度會(huì)顯著下降)，200×g (約1500rpm)離心5分鐘以沉淀少量漂浮的細(xì)胞或細(xì)胞碎片，取上清。上清樣品最好收集后立即檢測(cè)，也可以在室溫或4℃放置并當(dāng)天檢測(cè)，或者置于-80℃保存半年內(nèi)檢測(cè)。低溫保存的樣品檢測(cè)的時(shí)候須室溫融化并達(dá)到室溫后才可用于檢測(cè)。
標(biāo)簽：
支原體檢測(cè)步驟
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