一文掌握MIQE指南的RT-qPCR發(fā)表數(shù)據(jù)的實(shí)用方法
▲圖1：RT-qPCR基本流程
1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
正確的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是任何基因表達(dá)研究的關(guān)鍵。由于mRNA轉(zhuǎn)錄對(duì)與研究過程無關(guān)的外部刺激敏感，因此嚴(yán)格控制和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)條件的工作是十分重要的。其中包括了確定實(shí)驗(yàn)程序、對(duì)照組、重復(fù)組的類型和數(shù)量、實(shí)驗(yàn)條件以及各組內(nèi)的樣品處理方法等，這些對(duì)于最小化變異性至關(guān)重要（表1）。
▲表1：RT-qPCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品管理
2、RNA提取及質(zhì)控
樣品需-80℃冷凍或使用RNA儲(chǔ)存溶液進(jìn)行儲(chǔ)存。RNA提取程序應(yīng)包括DNA酶處理步驟，以去除任何的基因組DNA污染。
確保僅使用高純度（無污染物）和高完整性（未降解）的RNA是RT-qPCR實(shí)驗(yàn)工作流程中最關(guān)鍵的一點(diǎn)。RNA樣本中的雜質(zhì)可能導(dǎo)致RT和PCR的抑制，從而導(dǎo)致不同和不正確的定量結(jié)果。由于樣品純度和完整性不相關(guān)，因此應(yīng)評(píng)估兩者確定RNA樣本符合下游工作流程的最低驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。
▲表2 ：核酸質(zhì)量控制方法概述
3、逆轉(zhuǎn)錄
考慮到RNA酶在環(huán)境中的普遍存在，建議在質(zhì)量控制評(píng)估后立即將總RNA樣本反轉(zhuǎn)錄成cDNA。這將避免RNA樣品在轉(zhuǎn)化為cDNA之前多次冷凍/解凍而降解的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于RT步驟，關(guān)鍵是確保提取的RNA樣本中轉(zhuǎn)錄基因組的一致性和完整性。建議使用相同數(shù)量的總RNA，并保持所有實(shí)驗(yàn)樣本的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)間，以最小化生物復(fù)制之間的變異性。
4、引物和擴(kuò)增子設(shè)計(jì)
引物設(shè)計(jì)和靶序列的選擇是保證擴(kuò)增產(chǎn)物特異性和高效性的關(guān)鍵。目前有許多軟件或在線網(wǎng)站可設(shè)計(jì)引物對(duì)和確定擴(kuò)增子，比如DNAMAN、Primer Premier、Oligo、Beacon Designer、Primer-Blast、BathPrimer、Primer3 Plus等等。
5、qPCR驗(yàn)證
qPCR驗(yàn)證是使用一組標(biāo)準(zhǔn)樣品對(duì)引物退火溫度、反應(yīng)效率和特異性的適度范圍進(jìn)行評(píng)估的方法。具體步驟如下：
1.根據(jù)儀器類型，選擇合適的耗材和qPCR試劑；
2.配置不同的PCR反應(yīng)體系，凝膠電泳檢測(cè)引物適宜濃度以及特異性；
▲圖2：引物適宜濃度以及特異性測(cè)定
3.設(shè)置溫度梯度測(cè)試引物適宜退火溫度；
▲圖3：引物適宜退火溫度的測(cè)定
4.實(shí)驗(yàn)設(shè)置NTC、NRC、POS和NEG等對(duì)照組，來監(jiān)控實(shí)驗(yàn)體系或污染；
5.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立(評(píng)價(jià)PCR效率)。
▲圖4：標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖源:Azure Cielo™ qPCR系統(tǒng)
6、內(nèi)參基因的選擇
在RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因可以用于校正上樣量、上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。一個(gè)好的內(nèi)參基因應(yīng)在不同時(shí)空樣本或不同處理樣本中具有相對(duì)穩(wěn)定的表達(dá)水平，常見的有ATCB、GAPDH、β-actin、18S rRNA等。
7、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性
基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)中有兩種可能影響結(jié)果的變異來源：
1.由于個(gè)體有機(jī)體、組織或細(xì)胞樣品之間基因表達(dá)水平的固有差異引起的生物變異性；
2.實(shí)驗(yàn)過程本身的技術(shù)變異性，通常與移液器誤差、操作誤差或樣品質(zhì)量和數(shù)量有關(guān)。為了減輕生物和技術(shù)變異性的影響，一般認(rèn)為至少三次生物學(xué)重復(fù)和技術(shù)重復(fù)。
▲圖5 ：實(shí)驗(yàn)重復(fù)的設(shè)計(jì)
看完整個(gè)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)流程，您是不是撥開RT-qPCR神秘的面紗了呢，現(xiàn)在快快來申請(qǐng)Azure Cielo™ 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，來感受Azure Cielo™帶給您的真實(shí)可靠的RT-qPCR數(shù)據(jù)。
如果想了解詳細(xì)的內(nèi)容，請(qǐng)下載2020新版MIQE指南進(jìn)行查看，下載鏈接：http://www.econferences.de/miqe-qpcr-ibook/
Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)
Azure Cielo™ 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)來自美國(guó)Azure Biosystems公司，可為您提供3/6檢測(cè)通道，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求靈活配置。這款產(chǎn)品采用了高能LED作為光源系統(tǒng)，可保證光源強(qiáng)度高，光源一致性好；高品質(zhì)的帕爾貼溫度模塊作為溫控系統(tǒng)，升降溫速率快，可設(shè)置12列跨度30°C的溫度梯度；卓越的CMOS拍照+光纖信號(hào)傳輸作為檢測(cè)系統(tǒng)，CMOS檢測(cè)靈敏度高，光纖傳輸速度快，無光損失和噪音干擾，無需ROX校準(zhǔn)。Azure Cielo™實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)可為您的科學(xué)研究提供高精準(zhǔn)度、高靈敏度和高可靠性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
申請(qǐng)?jiān)囉?/strong>
動(dòng)動(dòng)手指識(shí)別下方二維碼，關(guān)注“深藍(lán)云生物科技”公眾號(hào)→云活動(dòng)→免費(fèi)試用；您也可以登錄深藍(lán)云官網(wǎng)：www.cycloudbio.com，點(diǎn)擊首頁右上角的試用申請(qǐng)進(jìn)行填寫。
