熒光定量Western上樣量疑惑解答與實(shí)際操作案例解析

熒光定量Western Blot，絕對(duì)不是上樣量越多越好�？煽康腤estern Blot印跡數(shù)據(jù)通過(guò)加載適當(dāng)量的樣品才能獲得。加載過(guò)多的蛋白會(huì)導(dǎo)致信號(hào)飽和或用于檢測(cè)的熒光基團(tuán)的自猝滅。

那么，您如何知道要加載多少裂解液呢？首先使用BCA或Bradford等蛋白測(cè)定方法測(cè)量裂解液樣品的濃度。一旦知道樣品的濃度，便可以確保每種樣品的加載量相同。

于此同時(shí)，您仍然需要一種方法來(lái)校準(zhǔn)凝膠加載量和轉(zhuǎn)印效率的問(wèn)題。蛋白印跡定量的最佳方法和新共識(shí)是將蛋白進(jìn)行歸一化。許多期刊都接受了總蛋白質(zhì)歸一化（TPN），有些期刊（例如《JBC》）甚至要求作者在Western印跡的定量數(shù)據(jù)時(shí)使用TPN或使用驗(yàn)證過(guò)的看家蛋白進(jìn)行歸一化。

在下面的實(shí)驗(yàn)中，加載了0.2-50µg的HeLa裂解物，以檢測(cè)靶標(biāo)蛋白STAT3與內(nèi)參對(duì)照GAPDH和總蛋白膜染色的性能。盡管Total-PVDF膜染色線性最高至50μg裂解物，但這顯然不是靶標(biāo)蛋白STAT3加載的理想上樣量，因?yàn)樾盘?hào)在12.5μg以上不再線性。上樣控制GAPDH的歸一化提出了一個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題，因?yàn)樗�在裂解物的濃度低�?µg時(shí)呈線性，因此其定量用途非常有限。

一般而言，我們建議不要加入超過(guò)20µg的裂解物，因?yàn)檫@通常會(huì)導(dǎo)致蛋白定量方面的問(wèn)題。為了獲得最佳的熒光定量Western印跡，不要忘記應(yīng)用適當(dāng)?shù)臍w一化策略并加載適量的蛋白。

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參考文獻(xiàn)：

1. Collecting and presenting data. The Journal of Biological Chemistry.

website.:http://jbcresources.asbmb.org/collecting-and-presenting-data#blot. Accessed February 4, 2019.

2. Fosang AJ and Colbran RJ. Transparency Is the Key to Quality. J Biol Chem. Dec. 11 2015. 290(50). 29692–29694. PMCID: PMC4705984.