IHC、ICC、IF免疫染色技術(shù)簡(jiǎn)介及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

免疫組織化學(xué)（IHC）是確定組織切片上蛋白的存在與否及存在位置的一種方法。盡管這種方法在定量分析時(shí)靈敏度較免疫印跡法或ELISA等免疫測(cè)定方法低，但是它能觀察到整個(gè)組織的情況，同時(shí)可以檢測(cè)目的蛋白在組織中的表達(dá)位置。適用于評(píng)估癌癥等疾病的發(fā)展及治療情況。因此，從IHC獲得的信息結(jié)合顯微技術(shù)給廣大科研工作者提供了一幅“宏圖”，使來自其它方法的數(shù)據(jù)有據(jù)可依。

免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）技術(shù)則是IHC技術(shù)在細(xì)胞樣本中的應(yīng)用，通過對(duì)懸浮/爬片細(xì)胞進(jìn)行免疫染色，可以檢測(cè)到目標(biāo)蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)位置和含量等信息，更加直觀。

IHC和ICC染色是抗體識(shí)別靶抗原的過程。因?yàn)榭贵w與抗原的結(jié)合是高度特異的，因此，它只與組織切片或細(xì)胞樣本中相應(yīng)的蛋白結(jié)合。應(yīng)用顯色檢測(cè)法即能看到抗原—抗體反應(yīng)，其顯色方法是將使用酶結(jié)合的抗體，在添加底物后，通過酶促反應(yīng)在蛋白位點(diǎn)產(chǎn)生色素沉著。另外一種方法是直接使用熒光染料標(biāo)記的抗體，將抗體識(shí)別與熒光顯色技術(shù)相結(jié)合，通過熒光顯微技術(shù)對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，這種方法通常被叫做免疫熒光（IF）。結(jié)合目前先進(jìn)的熒光顯微鏡成像技術(shù)，如激光共聚焦顯微鏡，IF可以得到檢測(cè)樣本的三維立體結(jié)構(gòu)，更加形象直觀。

要實(shí)現(xiàn)可靠一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)操作流程的優(yōu)化必不可少。IHC/ICC/IF的原理和實(shí)驗(yàn)步驟大體相同，整體實(shí)驗(yàn)流程如下圖所示。

免疫染色實(shí)驗(yàn)流程圖

二．設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)  
 
1.實(shí)驗(yàn)對(duì)照

實(shí)驗(yàn)對(duì)照：在進(jìn)行免疫組化染色時(shí)，必須證實(shí)組織內(nèi)顯示的反應(yīng)產(chǎn)物，確實(shí)是抗原與相應(yīng)的特異性抗體反應(yīng)所產(chǎn)生的。由于免疫組織化學(xué)染色中影響抗原、抗體和免疫反應(yīng)的因素很多，因此對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的評(píng)價(jià)必須設(shè)置對(duì)照組才能做出正確的判斷。常用的對(duì)照組有以下幾種：

陽性對(duì)照：用已證實(shí)含用待測(cè)抗原的組織，與待檢標(biāo)本做同樣處理后，進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果應(yīng)為陽性，稱為陽性對(duì)照。每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)做陽性對(duì)照，通過陽性對(duì)照可證明靶抗原有一定活性，染色過程中各個(gè)步驟以及所用的試劑都合乎標(biāo)準(zhǔn)，染色方法可靠。特別是當(dāng)待檢的標(biāo)本為陰性結(jié)果時(shí)，陽性對(duì)照呈陽性反應(yīng)，可排除待檢標(biāo)本假陽性的可能。所以若預(yù)期染色結(jié)果是陰性時(shí)，就必須設(shè)陽性對(duì)照。

陰性對(duì)照：用確知不存在待檢抗原的組織切片染色，結(jié)果為陰性。陰性對(duì)照可證實(shí)組織內(nèi)若不含靶抗原，就不應(yīng)染色，可排除在染色過程中由于非特異性染色或交叉反應(yīng)等因素造成的“假陽性”結(jié)果。

空白對(duì)照：是最常用的對(duì)照，用不加一抗的緩沖液，如PBS替代一抗，染色結(jié)果應(yīng)為陰性，說明染色方法可靠，可排除組織的內(nèi)源性過氧化物酶、堿性磷酸酶、自發(fā)熒光等物質(zhì)引起的非特異性顯色。

替代對(duì)照：用與第一抗體來源的同一動(dòng)物免疫前血清，如第一抗體用的是兔抗人GFAP的IgG抗體，對(duì)照中用非免疫性的正常IgG血清來替代一抗，以相同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行對(duì)照染色。這可證明待檢切片中陽性結(jié)果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是所用特異性抗體與組織細(xì)胞內(nèi)待檢抗原的特異性反應(yīng)的結(jié)果。但使用的商品抗體往往不能用同一種動(dòng)物的免疫前血清做替代對(duì)照，也可用未經(jīng)免疫的同種動(dòng)物血清，即非免疫血清替代一抗。

吸收試驗(yàn)對(duì)照：用過量已知相應(yīng)的純化抗原與第一抗體反應(yīng)，抗體結(jié)合點(diǎn)全部被抗原結(jié)合，這種被抗原吸收的抗體不能再與組織內(nèi)的抗原反應(yīng)，故再做免疫組化染色時(shí)，結(jié)果應(yīng)為陰性。

自身對(duì)照：用同一組織切片上與待檢抗原無關(guān)的其它結(jié)構(gòu)做對(duì)照。陰性反應(yīng)與陰性結(jié)構(gòu)同在一個(gè)視野中，相互印證，這本身就是對(duì)陽性反應(yīng)的特異性對(duì)照。但進(jìn)行科研工作中，單純用這種對(duì)照是不科學(xué)的。必須增加如空白對(duì)照、替代對(duì)照等，才能使染色結(jié)果得到承認(rèn)�，F(xiàn)代國(guó)際上發(fā)表文章，一般在免疫組化染色的同時(shí)，還須有Western blotting做相應(yīng)蛋白質(zhì)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果加以證實(shí)。

好的開始是成功的一半，在實(shí)驗(yàn)中尤其如此。一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)往往決定了實(shí)驗(yàn)的成敗。在正式試驗(yàn)開始前，最好設(shè)立一項(xiàng)小規(guī)模的預(yù)實(shí)驗(yàn)，可以確定某個(gè)抗體（尤其是新抗體）的最佳使用條件�？梢越柚�此小型預(yù)實(shí)驗(yàn)，解決操作流程中關(guān)鍵步驟的潛在問題，然后再開展規(guī)模較大的實(shí)驗(yàn)，這樣不僅節(jié)省時(shí)間，還能減少試劑消耗。

一抗是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵成分，其性能可直接影響到數(shù)據(jù)量。能用于免疫印跡法（WB）檢測(cè)特異性條帶的抗體無法充分保證適用于IHC/ICC/IF等實(shí)驗(yàn)。這是因?yàn)閃B分析將蛋白置于容易導(dǎo)致還原/變性的惡劣條件中，使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化（失去3D結(jié)構(gòu)，變?yōu)榫�性形式）。經(jīng)驗(yàn)證可用于WB的抗體識(shí)別表位，在IHC/ICC/IF實(shí)驗(yàn)中，因?yàn)榈鞍拙S持其天然狀態(tài)，則可能會(huì)被隱藏和/或被掩蓋。