活細(xì)胞成像實驗流程五步法指南獲取最佳圖像步驟
在設(shè)計活細(xì)胞成像實驗方案時，請參考輔助小工具和資源仔細(xì)考慮每一個步驟。
活細(xì)胞成像的優(yōu)點
- 可以觀察動態(tài)細(xì)胞過程的發(fā)生
- 能使用多色檢測同時對幾個細(xì)胞過程和細(xì)胞功能進(jìn)行研究和成像
- 可研究細(xì)胞在其原生環(huán)境中的結(jié)構(gòu)，從而獲得更接近體內(nèi)環(huán)境的更真實結(jié)果
- 實現(xiàn)隨時間追蹤細(xì)胞生物分子和結(jié)構(gòu)
- 可觀察細(xì)胞之間的相互作用
- 讓細(xì)胞酶和其他胞質(zhì)生物分子保留在細(xì)胞中
- 必須有一種特定的方法來以最小的毒性標(biāo)記您的研究靶標(biāo)-無論是分子、細(xì)胞功能還是細(xì)胞狀態(tài)
- 活細(xì)胞通常對于某些大的檢測分子是不可透過的，例如抗體
- 移動的目標(biāo)會更難保持聚焦
- 使用的某些技術(shù)是否可能對活細(xì)胞有害
- 細(xì)胞必須保持其自然生理狀態(tài)
在最佳條件下維持或培養(yǎng)細(xì)胞。
在各種實驗操作、標(biāo)記檢測和成像觀察過程中一直保持細(xì)胞存活和健康并非易事。對于延時成像和細(xì)胞長時間暴露于周圍環(huán)境條件下的實驗，培養(yǎng)基的選擇尤為重要。若要獲得可靠的活細(xì)胞成像實驗結(jié)果，非常重要的一點是：細(xì)胞必須健康并保持存在盡可能接近生理溫度、pH、氧氣水平及其他條件的環(huán)境中。
第 3 步: 細(xì)胞標(biāo)記用特異性染料和熒光標(biāo)記試劑靶向標(biāo)記細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞功能和目標(biāo)蛋白質(zhì)。
應(yīng)選用合適的熒光染料（特異性靶向的熒光蛋白或小的膜通透性試劑）來檢測目標(biāo)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或過程。可以使用其他熒光染料一起同時檢測多個細(xì)胞結(jié)構(gòu)和過程，但需要使用Fluorescence SpectraViewer（熒光光譜查看器）檢查激發(fā)光譜和發(fā)射光譜以確保不同熒光染料之間符合最小光譜重疊。切記盡量避免使用過多的熒光標(biāo)記，因為過多的熒光標(biāo)記會導(dǎo)致：
- 非特異性染色，背景信號增強
- 出現(xiàn)生理偽影和結(jié)構(gòu)擾動
- 細(xì)胞毒性
- 光譜重疊嚴(yán)重
- 活細(xì)胞結(jié)構(gòu)標(biāo)記試劑——是為了幫助鑒定細(xì)胞成份
- 活細(xì)胞功能檢測試劑——是為了幫助識別細(xì)胞功能和過程
盡可能降低背景并保持熒光信號的光穩(wěn)定性。
通過使用減少細(xì)胞外熒光并能增加熒光染料光穩(wěn)定性的試劑，可以最大程度的優(yōu)化信噪比。能夠維持細(xì)胞健康同時減少或消除活細(xì)胞成像實驗中背景熒光的培養(yǎng)基對于活細(xì)胞成像來說非常重要。加入適用于活細(xì)胞的背景抑制劑也有助于減少細(xì)胞外背景熒光，并且不需要額外清洗步驟。可以將活細(xì)胞抗淬滅試劑用于樣品，以減少熒光染料的光漂白，從而防止多次或長時間曝光導(dǎo)致信號丟失。
第 5 步：成像觀察動態(tài)過程的活細(xì)胞成像需要長期觀察
光照與檢測
為了使光毒性最小，推薦選擇可以最大程度地控制光源的成像系統(tǒng)。嘗試使用盡可能低的光強度、曝光時間、波長范圍和激發(fā)能量來照亮激發(fā)細(xì)胞，同時維持低背景下的良好信號。使用能夠以最低的熒光染料激發(fā)水平提供最高信號的光照。在某些情況下（特別是當(dāng)您希望長時間成像時），建議使用較短的曝光時間或較低的放大倍數(shù)，犧牲分辨率來獲得更健康的細(xì)胞。
較長時間的活細(xì)胞成像可能非常具有挑戰(zhàn)性，因為觀察目標(biāo)可能會在實驗過程中因移動而失焦。許多顯微鏡具有自動聚焦功能，可以幫助您保持更長的目標(biāo)聚焦時間并減少焦點漂移。另外，將細(xì)胞培養(yǎng)在恒定溫度并保持容器中溶液的體積恒定也有助于解決聚焦漂移問題。
環(huán)境控制許多細(xì)胞比較敏感不能允許偏離它們的最佳溫度、摩爾滲透壓濃度、pH 和濕度。具體要求因您所關(guān)注的實驗性問題而有所不同。例如，研究細(xì)胞生長和分裂的實驗與涉及受體激活和鈣積累的實驗相比可能有不同的要求。一些強健的永生細(xì)胞系可以允許短時期的成像或監(jiān)測，而無需任何環(huán)境控制。相反，對于長期成像和檢測研究，永生細(xì)胞和原代細(xì)胞的良好結(jié)果通常需要嚴(yán)格控制環(huán)境參數(shù)。
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在加入了Invitrogen CellTracker Deep Red 染料的 HDFn 細(xì)胞培養(yǎng)物中的劃痕實驗。（A）對照明區(qū)域進(jìn)行重復(fù)照明 10 小時。該區(qū)域中的細(xì)胞呈現(xiàn)出光毒性跡象（細(xì)胞活力喪失，因細(xì)胞無法生長到劃痕處）。（B）對比未照明區(qū)域中的細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，有活力的細(xì)胞可以生長至劃痕上。
