輔酶ⅠNAD(H)含量試劑盒說明書
測定意義
輔酶ⅠNAD(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循環(huán)（TCA）的主要氫受體，生成的NADH經(jīng)呼吸電子鏈（ETC）傳遞把電子交給氧，在合成ATP的同時，形成大量的ROS，同時NADH再生為NAD+。糖、脂、蛋白質(zhì)三大代謝物質(zhì)分解中的氧化反應(yīng)絕大部分通過這一體系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于評價糖酵解和TCA循環(huán)的強弱。較高的NAD(H)及NADH/NAD+比值說明細(xì)胞呼吸耗氧量較高，處于過氧化狀態(tài)。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循環(huán)。另外，NAD+降解產(chǎn)物對細(xì)胞信號傳導(dǎo)、代謝和基因表達(dá)等具有重要的調(diào)控作用。
測定原理
分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NAD+和 NADH，NADH 通過 PMS 的遞氫作用，還原
氧化型噻唑藍(lán)（MTT）為甲瓚，在 570nm 下檢測吸光值；而 NAD+可被乙醇脫氫酶還原為NADH，進一步采用 MTT 還原法檢測。
需自備的儀器和用品
酶標(biāo)儀、臺式離心機、移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
酸性提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存； 堿性提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 10 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：液體 3 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1 瓶，-20 ℃保存，用時加入 3mL 蒸餾水，混勻，用不完的試劑 4℃保存一周； 試劑四：粉劑×1 瓶，4 ℃保存，用時加入 3mL 蒸餾水，混勻，用不完的試劑 4℃保存一周； 試劑五：液體 3.6mL×1 瓶，4 ℃保存；
試劑六：液體 30mL×1 瓶，4 ℃保存； 試劑七：液體 50mL×1 瓶，4 ℃保存。NAD+和 NADH 的提取
1 血清（漿）中 NAD+和 NADH 的提取
NAD+的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
NADH 的提取：按照血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 堿性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2 組織中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD+的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g組織，加入 1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和， 混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
3 細(xì)胞或細(xì)菌中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD+的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：酸性提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 酸性提取液）， 超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），95℃水浴 5min
（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。NADH 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：堿性提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 堿性提取液）， 超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），95℃水浴 5min
（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。測定步驟：
1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 570nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 加樣表(在 1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加樣）：
| 試劑名稱(μL) | 對照管 | 測定管 |
| 樣本 | 20 | 20 |
| 試劑一 | 80 | 80 |
| 試劑二 | 30 | 30 |
| 試劑三 | 30 | 30 |
| 試劑四 | 30 | 30 |
| 試劑五 | 30 | 30 |
| 試劑六 | 200 | 混勻，室溫避光靜置 20min |
| 試劑六 | 200 |
| 試劑七 | 400 | 400 |
注意事項
1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。
2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。
3、反應(yīng)過程中注意避光。
4、若 NAD+測定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH 測定中△A（A2-A1）≤0.0222，說明樣本中輔酶含量較低，已低于檢測限，可做如下調(diào)整：（1）將測定管避光靜置時間 20min延長到 60min；（2）在提取階段增加取樣量，即取 0.2g 樣本或 0.2mL 樣本加入 1mL 提取液。 5、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管，本試劑盒 100 管保證測 48 個 NAD+或 NADH.
NAD+和 NADH 含量的計算
（一） NAD+含量的計算
標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.1475x + 0.0302，R2 = 0.9978；其中 y 為△A，x 為 NAD+濃度nmol/mL
1、血清（漿）中NAD+含量計算
NAD+含量(nmol/mL）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×( △A -0.0302）
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NAD+含量計算(1)按樣本蛋白濃度計算
NAD+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×( △A -0.0302）÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算
NAD+ (nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×( △A -0.0302）÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
NAD+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A -0.0302）
（二）NADH 含量的計算
標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為y = 0.1404x + 0.0222，R2 = 0.9976；其中 y 為△A，x 為 NADH 濃度 nmol/mL
1、血清（漿）中NADH 含量計算
NADH 含量(nmol/mL）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A -0.0222）
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADH 含量計算
(1) 按樣本蛋白濃度計算
NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×( △A -0.0222）÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算
NADH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×( △A -0.0222）÷W
(3) 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算
NADH (nmol/104 cell）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A -0.0222）
V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿） 體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)， 500 萬。
注意：最低檢測限為 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot
