Countstar Rigel細胞計數(shù)儀在原代細胞檢測中的應用

一、原代細胞的簡介以及應用 
原代細胞是指從機體內取出后立即培養(yǎng)的細胞，原代細胞不僅廣泛應用于分子、細胞生物學和生物醫(yī)學的基礎研究，如蛋白質組學、基因組學、細胞株(系)研究等，還可應用于當今熱門的生物醫(yī)藥產業(yè)如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。原代細胞在生物醫(yī)藥領域有不可替代性作用，市場前景廣闊。
 
二、原代細胞的提取方法
1、懸浮細胞的分離方法
組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，最簡單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘，以避免擠壓或機械損傷細胞，離心沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次，用培養(yǎng)基洗一次后，調整適當細胞濃度后再分瓶培養(yǎng)。.
 
2、實體組織材料的分離方法
（1）機械分散法
所取材料若纖維成分很少，如腦組織，部分胚胎組織可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細胞或將已充分剪碎分散的組織放在注射器內（用九號針），使細胞通過針頭壓出，或在不銹鋼紗網內用鈍物壓擠（常用注射器鈍端）使細胞從網孔中壓擠出。
（2）消化分離法
a、酶消化分離法
酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶
（a）胰蛋白酶分散技術
胰蛋白酶（簡稱胰酶）是廣泛應用的消化劑。胰蛋白酶是一種胰臟制品，對蛋白質有水介作用，主要作用于賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，使細胞間質中的蛋白質水介而使細胞分散開。胰蛋白酶對細胞的作用，取決于細胞類型、酶的活力、配制的濃度、消化的溫度、無機鹽離子、pH以及消化時間的長短等。
（b）膠原酶（Collagenase）消化法
適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織，它對細胞間質有較好的消化作用�？捎肞BS和含血清的培養(yǎng)液配制，即操作簡便又可提高細胞成活率，最終濃度0.1~0.3mg/mL.
b、非酶消化法（EDTA消化法）
常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對一些組織，尤其是上皮組織分散效果好。
 
三、原代細胞的計數(shù)
對于剛提取出來的原代細胞，用于后續(xù)試驗中，精準的細胞計數(shù)是必不可少的，雖然臺盼藍染色是常用的活細胞的計數(shù)方法，但是臺盼藍計數(shù)的缺點在于區(qū)分原代細胞內的雜質和碎片，對于原代細胞來說，臺盼藍染色計數(shù)出來的濃度與活率與真實值相差的比較大，對于后續(xù)的實驗有影響(圖1)。
 

利用Countstar雙熒光AO/PI的方法檢測可以有效避免雜質和碎片的影響，從而對細胞濃度和活率進行準確的計數(shù)。在Countstar Rigel系統(tǒng)中，具有完整細胞膜的有核細胞染綠色熒光并被計為活細胞，而具有受損細胞膜的有核細胞染紅色熒光并被計為死細胞，對于一些無核雜質和碎片不發(fā)光，Countstar Rigel可以把它們忽略掉。(圖2、圖3)