Annexin V/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟與常見(jiàn)問(wèn)題分析

Annexin V/PI 雙染法流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡是最常用的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法之一。在細(xì)胞開(kāi)始早期凋亡時(shí)， PS 會(huì)外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。用綠色熒光探針 YF488 標(biāo)記的 Annexin V，可以結(jié)合外翻的磷酯酰絲氨酸，從而檢測(cè)細(xì)胞凋亡的重要特征。 碘化丙啶（ Propidium Iodide, PI）是一種 DNA 結(jié)合染料，它可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞的細(xì)胞核。 PI 可以由 488,532 或 546 nm 的激光激發(fā)，呈現(xiàn)紅色熒光。

因此將 YF 488-Annexin V 與 PI 匹配使用，就可區(qū)分活細(xì)胞、早晚期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞。

YF488 染料與傳統(tǒng) FITC 相比，熒光亮度更高，且不受環(huán)境中 pH 的影響，具有良好的光穩(wěn)定性。

一、操作步驟（貼壁細(xì)胞為例）

1.1 對(duì)照管的設(shè)置

（1）空白管：誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞不加染料，用來(lái)調(diào)節(jié)電壓；

（2）單染管：分別需要只加 PI 和熒光標(biāo)記的 Annexin V 兩個(gè)單染管，用來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)償；

（3）實(shí)驗(yàn)管：誘導(dǎo)凋亡的細(xì)胞加本次實(shí)驗(yàn)的所有熒光染料；

（4）陰性管：正常培養(yǎng)細(xì)胞加入染料，確認(rèn)細(xì)胞正常狀態(tài)，排除假陽(yáng)性

1.2 細(xì)胞處理及染色

（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于 6 孔板或 6cm 培養(yǎng)皿（用什么培養(yǎng)皿取決于所培養(yǎng)的細(xì)胞，保證最終收集的細(xì)胞數(shù)大于 5×105 個(gè)）；

（2）根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要處理細(xì)胞。收集細(xì)胞時(shí)將培養(yǎng)液吸至離心管內(nèi)，PBS 洗滌細(xì)胞一次，用不含 EDTA 的胰酶消化細(xì)胞，并收集于離心管中（懸浮細(xì)胞可直接離心收集）；

注：用胰蛋白酶消化然后使細(xì)胞在最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復(fù)約 30 分鐘，然后再染色。 胰蛋白酶消化會(huì)暫時(shí)破壞質(zhì)膜，允許Annexin V結(jié)合磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)表面上，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性染色。

（3）將收集的培養(yǎng)基和細(xì)胞混勻，4℃ 300g 離心 5min，棄上清。用預(yù)冷的 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，每次 4℃ 300g 離心 5min；

（4）加入 1× Binding Buffer，將細(xì)胞調(diào)節(jié)成相同濃度（一般為 1×106/mL）；

（5）取 1-2×105 個(gè)細(xì)胞懸液于流式管中，加入適量標(biāo)記了熒光染料的 Annexin V 和適量 PI，輕輕混勻；

（6）室溫避光孵育 15-20 min；

（7）加入 300 μl PBS 重懸細(xì)胞，盡快（1 小時(shí)內(nèi)）用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

PS：對(duì)照管設(shè)置尤其重要

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

2.1 YF488-Annexin V 熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)效果

2.2 YF488 -Annexin V 流式實(shí)驗(yàn)效果圖

YF 488-Annexin V 與 PI 雙染試劑盒能夠完美的區(qū)分活細(xì)胞，早期凋亡細(xì)胞及晚期凋亡細(xì)胞/壞死細(xì)胞。

三、常見(jiàn)問(wèn)題

3.1 各象限代表的細(xì)胞狀態(tài)問(wèn)題

Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞。也可能有少數(shù)的晚期凋亡細(xì)胞在其中，甚至機(jī)械損傷的細(xì)胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，實(shí)驗(yàn)結(jié)果越不可信，建議實(shí)驗(yàn)中盡量控制這一象限細(xì)胞比例。

Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞。

Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞。

Q4：(AnnexinV-染料)-/PI-，此區(qū)域的細(xì)胞為活細(xì)胞。

3.2 補(bǔ)償調(diào)節(jié)問(wèn)題

（1）不同的染料組合，補(bǔ)償大小不同。

（2）電壓對(duì)補(bǔ)償?shù)挠绊懖恍�，電壓變補(bǔ)償變，所以我們要先調(diào)節(jié)FSC、SSC和熒光通道的電壓，電壓調(diào)好之后再調(diào)補(bǔ)償。

（3）細(xì)胞也是影響補(bǔ)償大小的一個(gè)因素，如淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間、活細(xì)胞與固定后細(xì)胞之間，標(biāo)記相同的熒光素偶聯(lián)抗體，使用相同的通道時(shí)，各通道之間的補(bǔ)償可能不同。所以當(dāng)細(xì)胞理化性質(zhì)差異較大時(shí)，最好重新調(diào)節(jié)新的樣品細(xì)胞的補(bǔ)償，確保獲得準(zhǔn)確的流式結(jié)果。

3.3 關(guān)于假陽(yáng)性問(wèn)題

（1）對(duì)貼壁細(xì)胞而言，消化是最關(guān)鍵的步驟，消化液需用不含 EDTA 的胰酶，因?yàn)?Annexin V 和 PS 的結(jié)合需要 Ca²⁺，而 EDTA 是 Ca²⁺ 螯合劑，使用含有 EDTA 的胰酶會(huì)造成假陰性。其次消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，吹打細(xì)胞要輕柔，因?yàn)橐让傅倪^(guò)度消化和機(jī)械損傷都會(huì)引起細(xì)胞膜的損傷，造成假陽(yáng)性。細(xì)胞消化下來(lái)后，建議在培養(yǎng)箱中在孵育 30min，使細(xì)胞膜恢復(fù)完整性，避免假陽(yáng)性，或者將細(xì)胞報(bào)訊在含 2% BSA 的 PBS 中，防止進(jìn)一步的損傷。

（2）神經(jīng)細(xì)胞膜容易破壞外翻，導(dǎo)致假陽(yáng)性，所以Annexin V/PI 雙染法流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡不適用于神經(jīng)細(xì)胞。

3.4 關(guān)于熒光染料選擇的問(wèn)題

（1） 對(duì)于熒光染料的選擇，建議如果流式細(xì)胞儀帶有 488 nm 和 633 nm 兩個(gè)或以上激光管，首先考慮用 APC 或 YF647 標(biāo)記 Annexin V，因?yàn)樗��?PI 通道幾乎不用考慮光重疊問(wèn)題，可以減少調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)臒�惱，如果只�?488 nm 激光管則可選擇YF488/FITC 標(biāo)記的 Annexin V。

（2）再次需要考慮細(xì)胞是否自帶熒光，因?yàn)楦腥静《净蛸|(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞往往帶 GFP 熒光，GFP 與 YF488/FITC 通道重疊，不能選擇 YF488/FITC 標(biāo)記的 Annexin V，此時(shí)如果只有 488 nm 一根激光管可以用 PE 標(biāo)記 Annexin V，用 7-AAD 代替 PI，或者改用 YF647 Annexin V 代替 YF488。

（3）最后還要考慮處理因素是否帶有熒光，本實(shí)驗(yàn)室就碰到過(guò)一個(gè)促凋亡藥物 Doxorubicin 本身發(fā)紅色熒光，對(duì) PI 通道的檢測(cè)造成嚴(yán)重干擾，而且濃度越大干擾越明顯。這時(shí)建議選用其他檢測(cè)方法。

3.5 設(shè)門(mén)問(wèn)題

（1）要特別注意在FSC/SSC圈門(mén)時(shí)，所選細(xì)胞范圍會(huì)對(duì)結(jié)果造成較大影響，所以在分析數(shù)據(jù)時(shí)，要把所有細(xì)胞都圈進(jìn)FSC/SSC的門(mén)內(nèi)，這樣實(shí)驗(yàn)結(jié)果才會(huì)更可信。如圖，使細(xì)胞群大概位于對(duì)角線上，并且細(xì)胞群較集中，群內(nèi)細(xì)胞比例要在80%以上，如果細(xì)胞全部圈入，細(xì)胞比例才50%或者更低，說(shuō)明細(xì)胞被壓在了坐標(biāo)軸上，這時(shí)要重新調(diào)節(jié)FSC和SSC。

（2）貼壁細(xì)胞做Annexin V凋亡檢測(cè)，通常分群不太規(guī)則，這時(shí)我們可以根據(jù)不加藥細(xì)胞來(lái)畫(huà)不規(guī)則的十字門(mén)。如下面圖形的設(shè)門(mén)方式。

3.6 免疫染色與凋亡染色順序問(wèn)題

Annexin V凋亡染色可以和抗體一起對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色嗎？

可以，但建議Annexin V和其它抗體分開(kāi)染色。 例如Annexin V、PI和CD3、CD8同時(shí)標(biāo)記淋巴細(xì)胞，可以先在PBS中標(biāo)記CD3/CD8后洗去，再在Binding buffer（含鈣離子）中標(biāo)記Annexin V。

3.7 其他問(wèn)題

（1）液氮保存的組織塊，不建議再做流式細(xì)胞分析。因?yàn)榱魇郊?xì)胞分析要求細(xì)胞分散、單個(gè)，活性好，組織在凍存、復(fù)溫的過(guò)程中會(huì)有大量的細(xì)胞死亡，同時(shí)經(jīng)過(guò)這一過(guò)程的組織在分離成單個(gè)細(xì)胞的時(shí)候會(huì)形成許多細(xì)胞碎片，不宜上流式檢測(cè)，所以用于流式檢測(cè)的標(biāo)本最好是新鮮標(biāo)本，即取材后立即檢測(cè)，效果最好。 液氮保存的組織塊，可以將組織標(biāo)本進(jìn)行切片，然后做原位染色，觀察組織細(xì)胞的凋亡。

（2） Annexin V也可以用在植物和細(xì)菌中檢測(cè)凋亡，具體實(shí)驗(yàn)步驟可參考相關(guān)文獻(xiàn)。

（3） 如果樣品來(lái)源于血液，必須去除血液中的血小板，因?yàn)檠�小板含有PS，能與Annexin V結(jié)合，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（4）操作中務(wù)必動(dòng)作輕柔，離心后確認(rèn)管底是否有細(xì)胞，經(jīng)常有人液體一甩，細(xì)胞也給甩走了。操作中還要注意避光。