檢測抗體間接法操作步驟

ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的敏感度.

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：
1）將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
2）加稀釋的受檢血清，保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去。
3）加酶標(biāo)抗抗體�？捎妹笜�(biāo)抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。
4）加底物顯色
本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。

間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)。抗原中也不能含有與酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發(fā)生假陽性反應(yīng)。另外如抗原中含有無關(guān)蛋白，也會因竟?fàn)幬�附而影響包被效果�?BR>
間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng)，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標(biāo)本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。