標準細胞冷凍、解凍方法指南-–實現(xiàn)重現(xiàn)性更高的細胞復蘇結果

在整個冷凍 - 儲存 - 解凍過程中，面臨的一項關鍵性挑戰(zhàn)是確保高細胞存活率，或許更重要的是確保超低溫保存細胞行為的可預測性和重現(xiàn)性。為此，人們制定了許多不同的指導方針和方案。

在超低溫保存過程中，造成細胞死亡的主要原因是胞內(nèi)冰晶的形成。以錯誤的方式冷凍時，會在細胞內(nèi)形成冰晶，這可能會損壞細胞膜和細胞器，從而大幅降低細胞恢復的可能性。

為了幫助防止形成胞內(nèi)冰晶，每個細胞冷凍方案都有兩項基本要求。第一項基本要求是在冷凍劑中加入低溫保護劑，二甲亞砜(DMSO) 或甘油等化合物會穿透細胞膜，這通常會降低培養(yǎng)基的凝固點和玻璃轉換溫度，從而防止在細胞內(nèi)形成冰晶 [2,3]。

圖 2： 建議使用液氮儲存區(qū)長期儲存細胞。

圖 3： 從液氮儲存區(qū)收集細胞時應注意防護。
圖片來源： Minerva Studio/shutterstock.com

接下來，必須將凍存管解凍。一個常用的經(jīng)驗法則是，在一個含有 1 mL 細胞懸液的標準凍存管中開始解凍細胞時，所有冰晶都會在幾分鐘內(nèi)消失，快速加熱可防止在解凍過程中出現(xiàn)局部再結晶，否則可能導致細胞損傷 [6]。

有時，由于尋找不同的凍存管所花費的時間或由于液氮儲存區(qū)的位置等因素，無法在幾分鐘內(nèi)完成解凍。在這種情況下，將緩慢解凍和將細胞留在解凍的冷凍劑中超過所需的時間相比，那么凍存管置于盡可能低的溫度下然后快速解凍的做法更加可取 [7]。

當所有的冰晶都消失后，需要盡量減小低溫保護劑對細胞的任何進一步的不利影響。有兩種方法可實現(xiàn)這一點。首先，可以直接培養(yǎng)細胞，例如在方瓶中培養(yǎng)，同時確保用正常培養(yǎng)基將冷凍劑稀釋至少 10 倍�；蛘�，也可以用普通培養(yǎng)基稀釋冷凍劑，把試管離心，移除培養(yǎng)基，然后在新鮮培養(yǎng)基中重新培養(yǎng)細胞 [1,4,7]。

為了檢查細胞解凍方案是否成功，建議測定存活細胞的百分比（例如，使用臺盼藍染色法和細胞計數(shù)器） [8]。為了改善標準，最好持續(xù)幾天觀察培養(yǎng)液中的細胞形態(tài)或生長速率有無任何異常。生長不良或不一致可能表示細胞制備或超低溫保存過程中出現(xiàn)問題，因此早期檢測可能有助于減少實驗誤差。

圖 4： 觀察解凍后培養(yǎng)液中細胞的形態(tài)是否異常。
正常(a)和異常(b)的細胞形態(tài)示例（Vero細胞， 10 x）

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在實驗室最常用的解凍冷凍細胞的方法可能是使用公用水浴槽（圖 4）。水具有良好的導熱性，可以保證快速加熱，同時也可以防止凍存管內(nèi)部局部過熱。水浴槽也是細胞培養(yǎng)實驗室日常使用的標準設備的之一，因此無需額外的準備或投資。

使用水浴槽或任何其他解凍方法加熱細胞時，切勿將細胞暴露在高于 37 °C 的溫度下。盡管加熱過程中的溫度總變化可能超過 200 °C，但如果管內(nèi)的局部溫度超過 37 °C，這會迅速誘發(fā)不良影響，甚至是細胞死亡 [9]。

然而，水浴槽的一個主要缺點是水和樣品接觸可能造成污染。由于水位、持續(xù)檢查凍存管的需要以及攪拌樣品以防止產(chǎn)生溫度梯度的要求，在解凍過程中很難保持凍存管頂部的干燥 [6]。

通過手動加熱凍存管將細胞解凍是一種廣受歡迎的方法，因為它不需要任何設備，主體溫度與水浴槽相似，而且使用戶能夠連續(xù)監(jiān)測并輕柔搖動凍存管。但必須注意，與將凍存管浸沒在水中相比，傳熱效率要低得多，變數(shù)也很多，這使得手動加熱凍存管的速度可能較慢，重現(xiàn)性也較低。

同時解凍兩個以上的凍存管時，手動加熱也不實用，還會導致冷卻速率減慢。此外，將皮膚暴露在接近–196 °C 的溫度下，即使佩戴了丁腈手套也會造成嚴重傷害。出于這些原因，不建議進行手動加熱。

當加熱細胞培養(yǎng)基或在培養(yǎng)箱外保持培養(yǎng)液的溫度時，可以使用金屬珠浴恒溫箱代替水浴槽。但是，與手動加熱或空氣加熱（例如在培養(yǎng)箱中）類似，珠子并不具備水浴槽的高效傳熱能力，因為與容器接觸的表面積較小，導致無法可靠地或足夠快速地解凍細胞。通常情況下推廣使用珠浴恒溫箱，因為珠浴恒溫箱不需要換水，但隨著時間的推移，灰塵和溢出物的積聚就需要清潔和重新安裝，以防止污染。

比較不同的細胞解凍方法時，不可避免地要考慮到許多實驗室特有的注意事項。其中一個要注意的事項是在潔凈室進行細胞培養(yǎng)時。在這種環(huán)境下，水浴槽可能成為空氣污染的來源，因此應考慮采用替代方法 [10]。

影響解凍方法選擇的另一個具體情況是，在細胞培養(yǎng)實驗室中工作時，需要記錄和跟蹤每一個工作步驟，或者需要保持恒定的加熱速率 [6,11]。當然，在選擇使用現(xiàn)有設備或使用專用裝置進行細胞解凍時，可用的實驗室設備預算具有關鍵性的影響。

在過去的十年中，一些制造商開發(fā)了可以不使用水浴槽而實現(xiàn)所需的快速加熱解凍的專用裝置。大多數(shù)裝置都是專為凍存管設計的，當然也有可以處理更大體積的系統(tǒng)。專用裝置可以設置程序執(zhí)行解凍過程。在對解凍過程的標準化和文檔化有更高要求的情況下，這將帶來許多好處。這些裝置也非常適合于不能實行水浴加熱的情況 [6]。專用解凍裝置最重要的缺點是需要前期投資。水浴槽解凍通常不需要額外的投資，而專用的解凍設備增加了細胞培養(yǎng)工作流的額外成本。另外，有些裝置一次只能解凍一個凍存管，導致可能與某些細胞培養(yǎng)方案不相容。

不管選擇哪一種方法，標準化都會大幅改善結果 — 無論是在監(jiān)管環(huán)境下工作還是基礎研究。例如，保持一致的細胞存活率可以減少解凍過量細胞的需要，從而可確保擁有足夠的細胞儲備，當細胞量較少時這就尤為重要。

方案標準化也會影響細胞在平板培養(yǎng)后的行為。例如，當長時間暴露于 DMSO 時，一些類型的細胞更有可能發(fā)生分化 [12]。因此，冷凍或解凍方案的變化可能會導致超低溫保存后細胞表型的差異和結果的變化。

有許多冷凍和解凍方面適用于所有細胞類型，但必須注意，一些方面可能因某些細胞類型而異，因此應盡可能使用適合特定細胞類型的解凍方案。許多商業(yè)細胞系已經(jīng)過全面的研究并且優(yōu)化了超低溫保存方案，但對于不常見的細胞類型，建議進行文獻檢索或進行小規(guī)模的優(yōu)化研究。

每種細胞類型的細胞解凍都各不相同，需要密切關注細胞恢復正常生長和正常響應刺激物所需的時間。例如，如果增殖速率是研究的一個關鍵參數(shù)，很重要的一點是，不要從尚未完全從解凍過程中恢復的細胞開始實驗 — 因為不同類型的細胞之間可能存在較大差異。比如，當測量特定蛋白的表達時，細胞需要完全恢復產(chǎn)生這種蛋白的能力 [7]。
 

為了在細胞培養(yǎng)實驗室獲得一致的結果，務必在細胞培養(yǎng)的每一步實現(xiàn)高水平的標準化。細胞解凍有多種不同的方法可供使用 — 在設定可靠數(shù)據(jù)和可靠產(chǎn)品的正確標準時，選擇適合每種特定的細胞類型、實驗室或應用的細胞解凍方案是關鍵。
 

[1]https://www.lgcstandards-atcc.org/Documents/Marketing_Literature /Animal_Cell_Culture_Guide/Cryopreservation.aspx

[3] Oishi, K et al. Cryopreservation of Mouse Adipose Tissue-Derived Stem/Progenitor Cells.
Cell Transplantation 2008; 17: 35–41.
[4] https://www.lgcstandards-atcc.org/How_to_Revive_Cultures.aspx
[5] https://www.labmanager.com/lab-health-and-safety/keeping-cool-under-pressure-5552
[6] Hunt, CJ. Technical Considerations in the Freezing, Low-Temperature Storage and Thawing of Stem Cells for Cellular Therapies. Transfusion Medicine and Hemotherapy 2019; 46: 134–149.
[7] Baust, JM et al. Best practices for cryopreserving, thawing, recovering, and assessing cells.
In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal 2017.
[8] Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology 2019.
[9]https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/358505-Cryopreservation-Freezing-Solutions
[10] https://www.news-medical.net/life-sciences/What-are-Cleanrooms.aspx
[11]https://www.bioprocessonline.com/doc/cell-thawing-are-you-risking-gmp-compliance-with-the-water-bath-method-0001
[12] Best, BP. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research 2015; 18(5): 422–436.