分子垂釣技術要點與應用實例

就是這么簡單！Octet和分子垂釣！
 
分子垂釣是生命科學研究中的常用手段，簡單來說就是從一個分子庫里（比如某個細胞裂解液的粗樣品）釣取可以與已知生物分子相結合的配體分子。一般先將這個已知分子偶聯(lián)在固相上面，然后和細胞裂解液里的物質結合，最終將洗脫下樣品交由質譜進行鑒定。
  
一個成功的垂釣實驗會涉及到幾個重要因素
 
1     將已知分子牢固地偶聯(lián)到固相上，并保持其生物活性；
2     盡量減少混合樣品和固相之間的非特異性結合；
3     確保洗脫的物質有足夠的量來做質譜（濃度盡可能高，避免濃縮處理導致的損耗）；
4     對垂釣鑒定結果進行驗證。應用經(jīng)純化的樣品，再次通過分子互作技術進行表征鑒定。
  
目前最常用的垂釣方法是Pull-Down，但是其缺點是非特異性高，操作麻煩�，F(xiàn)在基于生物層干涉技術（BLI）的Octet分子互作儀器以及傳感器，針對這幾個問題進行了積極的優(yōu)化和改進，成為做分子垂釣的新方法。
 
今天陳老濕給大家介紹一篇文章，來自于意大利國家研究委員會下屬的生物結構和生物成像研究所的。他們在研究中發(fā)現(xiàn)了針對某一腫瘤標志物的抗體，并成功應用BLI技術垂釣和鑒定出這個抗體的表位（抗體結合位點）【1】。
 
  Preferentially Expressed Antigen in Melanoma (PRAME，黑色素瘤特異性抗原) 是重要的腫瘤標志物和治療靶點�？茖W家通過研究，發(fā)現(xiàn)了針對這個抗原的高親和力抗體。接下來的工作就是希望通過分子垂釣技術，對該抗體的識別表位開展鑒定工作。
 
下圖是做表位垂釣和鑒定的技術路線
 
1     先用BLI鑒定抗體與抗原結合。用胺基偶聯(lián)傳感器固化抗體，通過與抗原進行結合解離得到的數(shù)據(jù)，確認該抗體與抗原的結合親和力較高；
2     將抗原用胰蛋白酶消化成多肽，并用質譜開展鑒定。通過同蛋白序列的分析對比，發(fā)現(xiàn)這些多肽序列的覆蓋率很高，從而確認抗原預處理是成功的；
3     應用Octet AR2G（胺基偶聯(lián)傳感器）固化抗體，抓取抗原消化產(chǎn)物，并用質譜開展鑒定；
4     對鑒定得到的能與抗體結合的多肽序列進行人工合成，并標記上生物素標簽；
5     采用Octet互作分析儀，用鏈霉親和素（SA）傳感器固化生物素化多肽，與抗體結合解離，鑒定多肽與抗體的親和力。


由此可見，Octet不僅可以作為整個抗原和表位多肽的親和力鑒定手段，同樣也是用于垂釣表位多肽的工具，兩全其美！
 
  作者將幾微升1μM濃度的抗原進行消化后，將其與固化了抗體的AR2G傳感器在試管中孵育3分鐘。隨后用PBS緩沖液洗滌1分鐘，最后用0.1%的TFA洗脫（該洗脫液可以兼容質譜）。重復該過程10次以確保積累足夠多的洗脫產(chǎn)物。
  BLI垂釣的質譜鑒定結果：除去一些角蛋白的污染物多肽（K2,K3,K4）外，有一個PRAME（202-212）相關的多肽片段。

通過BLI技術發(fā)現(xiàn)并確認了PRAME與抗體的潛在表位位置在202-212！另外，陳老濕必須提醒大家，在質譜鑒定垂釣產(chǎn)物中，角蛋白相關多肽作為污染物被發(fā)現(xiàn)的概率非常高。因為這個蛋白大量存在于皮膚毛發(fā)中，所以其作為污染物可能在EP管等各種溶液容器中普遍存在，請大家在做實驗的時候盡量注意這點。
  BLI的傳感器還有一個優(yōu)點就是可以和PCR管完美配合。只要在PCR管里加入10ul左右的樣品或者洗脫液，并將傳感器直接插入試管，就可以輕松完成垂釣。
 
   潛在位點畢竟是潛在位點，垂釣畢竟是垂釣，對這個多肽與抗體的結合進行進一步鑒定是必不可少的。這個基于BLI技術的非標記技術和直接結合（direct binding）又可以大顯身手了。BLI技術可直接對兩個生物分子之間進行實時的相互作用檢測，最大程度保證結果的真實性。同時實時監(jiān)測的結果能夠為研究者展示相互作用的過程，得到Kon、Koff、KD等重要的動力學表征參數(shù)。Octet系統(tǒng)憑借測試速度快，步驟少，自動化程度高，數(shù)據(jù)重復性好，結果準確率高等優(yōu)點，已成為當前市場上最主要的分子互作工具之一。
      應用Octet開展分子垂釣的優(yōu)勢
1     提供多種傳感器固化已知分子
2     可以到達到ng級以上的洗脫量（如果傳感器上結合量夠大，做SDS-PAGE都夠，請看這里），并實現(xiàn)微量洗脫
3     提供較低非特異性吸附的基質
4     通過直接結合實驗來驗證鑒定垂釣產(chǎn)物
5     易于操作，實驗成本低 
 
   
-參考文獻-
【1】Development of a New Highly Selective Monoclonal Antibody against Preferentially Expressed Antigen in Melanoma (PRAME) and Identification of the Target Epitope by Bio-Layer Interferometry. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 3166. https://doi.org/10.3390/ ijms22063166