從試劑到定量：抗體內(nèi)化一站式分析方案

單克隆抗體目前被廣泛用于抗癌、抗炎和抗病毒治療�？贵w的一個重要特性是細胞內(nèi)化的程度、位置和速度。抗體偶聯(lián)藥物（ADC）的作用機制是向細胞內(nèi)輸入細胞毒性物質(zhì)引起細胞毒性殺死腫瘤細胞，其特異性和細胞的攝取程度對ADC的有效性和安全性至關(guān)重要。

因此，了解抗體在細胞內(nèi)的內(nèi)化，并能夠比較不同抗體的攝取情況，是生物藥物發(fā)現(xiàn)抗體選擇和優(yōu)化的關(guān)鍵要求。

檢測和篩選抗體內(nèi)化的傳統(tǒng)方法在應(yīng)用上仍然存在一些短板：

1	采用終點式檢測，每次檢測只能獲得一個時間點的結(jié)果，無動態(tài)數(shù)據(jù)
2	檢測時因缺少環(huán)境控制而導致細胞變化
3	需多平臺聯(lián)合使用，才能準確定量
4	無法實時觀察到內(nèi)化動態(tài)過程
5	無法滿足高通量篩選需求

Incucyte可提供從試劑到定量分析的一整套，抗體內(nèi)化實時觀察和定量的解決方案。
 

圖1.Incucyte抗體內(nèi)化實驗方案

 

 Incucyte抗體內(nèi)化的主要優(yōu)勢 

一步法抗體標記試劑，無需清洗和優(yōu)化
 

圖2.FabFluor抗體標記試劑檢測原理
 

• Incucyte FabFluor抗體標記試劑是一個與pH敏感的熒光探針結(jié)合的Fc區(qū)域靶向Fab片段，與抗體的Fc端結(jié)合形成Fab-Ab復合物；
• 在常規(guī)培養(yǎng)基中（pH 7.0）,Fab-Ab沒有熒光或熒光很微弱，內(nèi)化后其環(huán)境pH降低（pH4.7—6.3），F(xiàn)ab-Ab發(fā)出明亮的紅色熒光；
• 使用簡單快速，常溫孵育15min即可，無需清洗和優(yōu)化。

實時觀察，評估抗體內(nèi)化的時間依賴性變化
 
圖3.Incucyte FabFluor標記的α-CD71抗體內(nèi)化到HT1080細胞的動態(tài)分析。HT1080細胞分別用FabFluor標記的α-CD71和IgG處理，用Incucyte10X鏡頭，相差成像和紅色熒光成像，拍照間隔15min，共計12h。與同型對照IgG(B)對比，α-CD71標記的實驗組（A）有明顯的紅色熒光，表明該抗體能內(nèi)化到HT1080細胞內(nèi)；（C）Incucyte軟件定量曲線，抗體內(nèi)化隨時間逐步增加。

抗體內(nèi)化的藥理學動態(tài)定量分析
 

圖4. 不同濃度的Herception內(nèi)化到BT-474 Her2陽性乳腺癌細胞的動態(tài)分析及劑量反應(yīng)曲線。(A)不同濃度的Herceptin-Fabfluor，其內(nèi)化成濃度依賴性上升；(B)曲線下面積計算，顯示內(nèi)化呈濃度依賴性上升，并得到EC50為426ng/ml。

可用于抗體的高通量篩選，提高工作效率
 

圖5. 6種抗體8個濃度梯度經(jīng)Fabfluor標記后內(nèi)化到HT1080細胞。AB1a,AB1b,AB2這3種抗體在低濃度時即有內(nèi)化現(xiàn)象；AB3,AB4,AB5只在高濃度時才會發(fā)生內(nèi)化現(xiàn)象。

Incucyte可用于96孔板多種抗體多種濃度的同時篩選，也可擴大到384孔板，大大提高工作效率。

活細胞成像系統(tǒng)及相關(guān)抗體內(nèi)化試劑為直接研究抗體在細胞內(nèi)的內(nèi)化提供了一個簡單、集成和定量的解決方案，該解決方案可以很容易地同時比較多種抗體。這種方法使抗體內(nèi)在化測量能夠在生物制劑發(fā)現(xiàn)過程的早期階段實施，并對新型治療性抗體的有效性、安全性和藥代動力學優(yōu)化有價值。此外，該方法也適用于理解內(nèi)吞作用、胞飲作用的基本機制。
 

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