新手須知的qPCR操作技巧詳解（下篇）

上一篇文章跟大家介紹了qPCR實驗中引物設計及加樣的相關操作技巧，今天我們再跟大家分享其他的實用技巧，這些入門級知識一定要掌握牢固哦。
 

1、陰性對照的技巧：

陰性對照一般是指用水代替模板的反應孔，體系中除了模板，包括了其他的反應組分。由于qPCR的高靈敏性，陰性對照有出現(xiàn)擴增信號的情況，那么在針對這類問題時，我們需要判斷其原因所在。
 

使用染料法進行qPCR實驗時，首先查看陰性對照的溶解曲線主峰是否跟陽性孔的主峰位置一致。如果一致，要看兩者Cq相差多少，比如，針對某一種引物的實驗樣品Cq值為28. 5，陰性對照的Cq值為33. 6，由于Cq值相差大于5，如果按95%的擴增效率計算，兩者模板量相差28倍之多，對分析數(shù)據(jù)影響不大，所以實驗樣品的Cq值還是可以采用的；但是，如果兩者的Cq值僅相差 1~2，這說明陰性對照中有較大的模板污染，則需要考慮更換試劑或引物，分區(qū)加樣，重新實驗。如果不一致，陰性對照主峰對應的Tm值小于陽性孔的Tm值，則可能是引物性能不好，無模板或使用低濃度模板下會出現(xiàn)引物二聚體，這種情況則需要考慮更換引物，保證引物特異性以及擴增效率。
 

▲ 圖1：溶解曲線主峰位置基本一致時，S3是實驗樣品，NTC是陰性對照，

兩者Cq相差大于5，實驗樣品的Cq值還是可以采用的。
 

▲ 圖2：溶解曲線主峰位置不一致時，STD-1是高濃度樣品，STD-5是中濃度樣品，

STD-8是低濃度樣品，NTC是陰性對照。隨著模板濃度降低逐漸出現(xiàn)引物二聚體，
導致擴增效率測得不準確。
 

使用TaqMan探針法進行qPCR實驗時，由于探針法的高特異性，如果陰性對照出現(xiàn)擴增信號，很大可能是模板污染或氣溶膠污染導致，操作時注意分區(qū)加樣，避免污染。
 

2、結(jié)果分析的技巧：

進行相對定量分析時，最常用到的是 2-ΔΔCq法，但是這種方法比較粗放，因為它的前提是假定所有引物的擴增效率都為100%。更為準確的定量則需要考慮不同引物擴增效率的差別。可首先用梯度稀釋的模板測試各引物的擴增效率E，獲得實際擴增效率之后，后續(xù)實驗只需要在軟件中直接輸入擴增效率E值，即可計算更精準的相對定量值。
 

在Azure Cielo™ 實時熒光定量PCR系統(tǒng)中可在分析界面輸入擴增效率E值，完成更精準的相對定量值的計算，如圖所示：
 

Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)

Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)來自于美國Azure Biosystems公司，配備高品質(zhì)溫度模塊，采用光纖和CMOS的檢測系統(tǒng)，高能LED的激發(fā)，提供高靈敏和可靠的數(shù)據(jù)。
 

▲ Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)