密碼子優(yōu)化在提高異源蛋白表達(dá)量中的作用

我們在開展異源基因表達(dá)實驗時，常常會遇到這樣的問題，就是異源基因在宿主細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量很低。疑惑的是所表達(dá)的蛋白既不是毒蛋白，且所用的也是強(qiáng)啟動子，那為什么還會出現(xiàn)這種問題呢？這時候我們可以考慮是不是存在密碼子偏好性的問題，可以通過密碼子優(yōu)化來提高異源基因在宿主細(xì)胞中的蛋白表達(dá)量。

什么是密碼子的偏好性
密碼子的偏好性是指不同生物在翻譯過程中對簡并密碼子的使用頻率存在差異，而在進(jìn)化的過程中形成了一套與其相適應(yīng)的常用密碼子。蛋白質(zhì)在翻譯的過程中，是由tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸至核糖體中，mRNA中的三聯(lián)體密碼決定氨基酸序列（圖1）。由于密碼子存在簡并性，因此同一種氨基酸可以由多個密碼子編碼。這意味著有61種可能的tRNA，而在生物體中都表達(dá)61種tRNA的可能性不高，并且每種tRNA的表達(dá)豐度也會存在差異。那當(dāng)外源基因的密碼子所對應(yīng)的tRNA在宿主細(xì)胞中的表達(dá)量低時，則會影響它的翻譯效率。
 

圖1. 肽鏈的合成過程（Image from Mariana Ruiz Villarreal）

什么是密碼子優(yōu)化
密碼子優(yōu)化是通過基因工程技術(shù)，根據(jù)宿主的密碼子偏好性調(diào)整基因的同義密碼子，達(dá)到消除稀有密碼子的目的，并且優(yōu)化如mRNA二級結(jié)構(gòu)和Motif等相關(guān)參數(shù)，從而提高翻譯效率。當(dāng)異源基因在宿主中無法有效表達(dá)時，可以考慮進(jìn)行密碼子優(yōu)化，調(diào)整同義密碼子和相關(guān)的調(diào)控元件，提高翻譯效率。通過這種方法提高異源基因翻譯效率的報道已經(jīng)很多。如為了在人胚胎腎細(xì)胞（HEK293T）中提高重組豬白細(xì)胞介素-7（pIL-7）的表達(dá)，崔丹等依據(jù)人密碼子的偏好對pIL-7基因進(jìn)行了優(yōu)化修飾，結(jié)果顯示，密碼子優(yōu)化后pIL-7基因在HEK293T細(xì)胞中的表比野生型pIL-7基因的表達(dá)水平提高了2倍多，可見密碼子優(yōu)化可明顯提高重組pIL-7在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)[1]。
 

圖2. 密碼子優(yōu)化型IL-7基因表達(dá)水平與其野生型基因的比較[1]

密碼子優(yōu)化需考慮的因素
密碼子優(yōu)化需要綜合考慮多種因素，才能取得良好的優(yōu)化效果。不是簡單地將外源基因的同義密碼子調(diào)整為宿主細(xì)胞中表達(dá)豐度高、使用頻率高的密碼子就能提高蛋白的翻譯效率，有時候效果往往會適得其反。因此密碼子優(yōu)化并不是一個簡單的實驗。下面我們介紹密碼子優(yōu)化時需要注意的主要因素：

1. 用宿主中最相似頻率的同義密碼子替換原序列密碼子。如上述所言，生物體翻譯過程中存在密碼子的偏好性，若是在基因的同義密碼子使用頻率與表達(dá)宿主相匹配的情況下，蛋白的表達(dá)水平則會顯著提高。匹配程度常用密碼子適應(yīng)指數(shù) （Codon Adaption Index，CAI）來表示，通常情況下，CAI≥0.80被認(rèn)為是預(yù)測重組蛋白高效表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)。并且在設(shè)計時要避免連續(xù)兩個以上稀有密碼子同時存在，否則很可能會導(dǎo)致翻譯效率急劇降低，甚至可能會終止肽鏈的合成。

2. mRNA二級結(jié)構(gòu)。mRNA的二級結(jié)構(gòu)對翻譯效率具有一定的影響。當(dāng)mRNA因其序列而形成復(fù)雜穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)時，會降低翻譯效率。尤其是序列里有和核糖體結(jié)合位點或翻譯起始位點互作的序列，會阻止翻譯的進(jìn)行，合理優(yōu)化翻譯起始區(qū)的mRNA二級結(jié)構(gòu)，將有效提高目的蛋白表達(dá)水平。

3. 避開某些限制性酶切位點。在密碼子優(yōu)化時避免形成構(gòu)建載體時所需要的酶切位點，以免酶切位點產(chǎn)生沖突，影響構(gòu)建表達(dá)載體的操作。

4. GC含量要合適。GC含量能影響DNA的穩(wěn)定性，間接影響基因的表達(dá)調(diào)控，當(dāng)GC含量超過70%可能會降低蛋白的表達(dá)。

5. 調(diào)整Motif和剪切位點。如增強(qiáng)子、Shine-Dalgarno序列的特異核糖體結(jié)合序列、TATA box等順式作用原件能促進(jìn)或者抑制基因的表達(dá)量。因此調(diào)整相關(guān)Motif能提高蛋白的表達(dá)量。而去除內(nèi)含子屬性的剪接位點，也能提高蛋白表達(dá)成功率。

密碼子優(yōu)化的風(fēng)險
密碼子優(yōu)化能夠提高蛋白質(zhì)的翻譯效率，從而提高蛋白的表達(dá)量。但是改變密碼子也可能產(chǎn)生潛在不利的影響，如密碼子優(yōu)化可能影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象、折疊和穩(wěn)定性等[2]。核糖體在肽鏈延伸的過程中可能減慢速度，不過這是肽鏈以正確折疊的重要步驟[3]。另外，不同的tRNA會影響翻譯的效率，這就可能影響核糖體對肽鏈的加工時間。

參考文獻(xiàn)：
[1]崔丹, 溫潔霞, 霍珊珊等. 密碼子優(yōu)化提高豬IL-7在HEK293T細(xì)胞表達(dá)的研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2017, 第40卷（6）:88-92.

[2]Mauro, Vincent P., and Stephen A. Chappell. “A Critical Analysis of Codon Optimization in Human Therapeutics.” Trends in Molecular Medicine, vol. 20, no. 11, 2014, pp. 604–613.

[3]Stadler, Michael, and Andrew Fire. “Wobble Base-Pairing Slows in Vivo Translation Elongation in Metazoans.” RNA, vol. 17, no. 12, 2011, pp. 2063–2073.

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