如何有效分析神經(jīng)細(xì)胞表型：亮點(diǎn)應(yīng)用與高分文獻(xiàn)分享

過去幾十年，神經(jīng)科學(xué)研究取得有目共睹的發(fā)展。盡管如此，了解人腦和神經(jīng)系統(tǒng)作用，發(fā)現(xiàn)致病機(jī)理，開發(fā)新型、有效的治療藥物仍然非常具有挑戰(zhàn)。
 
干細(xì)胞技術(shù)的最新進(jìn)展為神經(jīng)科學(xué)研究提供了有效替代途徑,，利用人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）來分化創(chuàng)造神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞等支持細(xì)胞，為建立具有人源化和患者特異性的高級細(xì)胞模型提供更大可能。iPSCs模型需要大量的工作優(yōu)化重編程和分化方法，還需構(gòu)建可靠的細(xì)胞生物學(xué)分析方法對模型的病理生理學(xué)特征和代表性進(jìn)行驗(yàn)證。
 
  使用活細(xì)胞成像技術(shù)對體外疾病模型進(jìn)行表型分析是一種有效的手段，能夠長期鑒定神經(jīng)細(xì)胞的功能。活細(xì)胞成像技術(shù)能夠連續(xù)地采集細(xì)胞圖像，并通過對整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行監(jiān)測（從細(xì)胞制備、分化、編輯到動力學(xué)分析），提供全面的分析數(shù)據(jù)。鑒于神經(jīng)細(xì)胞的特點(diǎn)，在培養(yǎng)箱中直接進(jìn)行活細(xì)胞成像分析的方法（如Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞成像）可以避免環(huán)境因素對神經(jīng)細(xì)胞的影響，確保數(shù)據(jù)的連續(xù)性和準(zhǔn)確性。通過結(jié)合自動化延時(shí)成像和實(shí)時(shí)定量分析的特點(diǎn)，提供可視化的細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動等表型分析結(jié)果。  近年來，Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)科研中，小賽總結(jié)了以下四個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用和高分文獻(xiàn)與大家分享：
    神經(jīng)退行性疾�。∟D），如阿爾茨海默病(AD)或帕金森病(PD)，是一種引起記憶喪失、運(yùn)動障礙等失調(diào)反應(yīng)的慢性病。很多ND的特征表現(xiàn)為大腦中蛋白質(zhì)的異常形成和聚集，逐步引起神經(jīng)元的退化或死亡。

改進(jìn)的體外細(xì)胞模型更好地反映了疾病的慢性本質(zhì)，利用活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像技術(shù)對原代細(xì)胞或iPSCs等先進(jìn)的細(xì)胞模型進(jìn)行分析，為ND的發(fā)病機(jī)理研究及有效治療藥物的開發(fā)提供了更大的便利和可能性。
 

1. 研究藥物誘導(dǎo)引發(fā)的效應(yīng)：使用非干擾試劑實(shí)時(shí)研究疾病相關(guān)的神經(jīng)毒性（圖1）
2. 洞察細(xì)胞健康和形態(tài)：實(shí)時(shí)獲得全方位動態(tài)數(shù)據(jù)（圖2，3）
3. 深入了解ND發(fā)病機(jī)理：評估神經(jīng)退行性疾病模型中神經(jīng)元的活動（圖4）
4. 可用于2D和3D模型：兼容iPSCs、原代細(xì)胞，適用于單培養(yǎng)和共培養(yǎng)（圖5）

 

圖1. 體外慢性病模型反映Tau蛋白聚集誘導(dǎo)神經(jīng)突長度變化

圖2. 在PD動力學(xué)模型中，Oxidopamine (6-OHDA)治療增加細(xì)胞死亡并減少神經(jīng)突生長

圖3. PD模型中的腦區(qū)域特異性：與皮層區(qū)域相比，6-OHDA選擇性地影響黑質(zhì)和紋狀體神經(jīng)突的生長

圖4. 功能評估顯示Tau蛋白導(dǎo)致神經(jīng)元活動減少

圖5. 患者來源的AD iPSC模型：2D和3D顯示不同的神經(jīng)突發(fā)育和球狀形成
 

1. DDX3X acts as a live-or-die checkpoint in stressed cells by regulating NLRP3 inflammasome. Nature, 2019, 573(7775): 590-594.
2. Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis. Cell, 2019, 179(6): 1289-1305. e21.
3. Regulation of the RNAPII pool is integral to the DNA damage response. Cell, 2020, 180(6): 1245-1261. e21.
4. Target-based discovery of an inhibitor of the regulatory phosphatase PPP1R15B. Cell, 2018, 174(5): 1216-1228. e19.
5. CD22 blockade restores homeostatic microglial phagocytosis in ageing brains[J]. Nature, 2019, 568(7751): 187-192.

  神經(jīng)腫瘤涉及神經(jīng)系統(tǒng)癌癥（包括腦和脊髓）。腦腫瘤侵略性很強(qiáng)且危及生命，為尋找有效的治療方法帶來了很多挑戰(zhàn)。腫瘤的準(zhǔn)確定位關(guān)乎有效治療藥物的傳遞。高細(xì)胞異質(zhì)性，神經(jīng)細(xì)胞的有限再生能力，耐藥性以及脫靶神經(jīng)毒性都會影響治療效果。

有效可靠的體外轉(zhuǎn)化模型有利于我們更深入地了解腦腫瘤的發(fā)病過程，從而開發(fā)新的有效治療方法進(jìn)行干預(yù)。實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析技術(shù)能夠借助2D和3D模型對腦腫瘤細(xì)胞的健康及形態(tài)進(jìn)行長期、持續(xù)性監(jiān)測。
 

1. 細(xì)胞健康的量化及可視化：在培養(yǎng)箱中實(shí)時(shí)、自動化檢測細(xì)胞凋亡（圖1）
2. 實(shí)體腦腫瘤模型建立：通過免標(biāo)記技術(shù)量化細(xì)胞增長及細(xì)胞活性，研究三維腫瘤球形態(tài)（圖2，3）
3. 藥理學(xué)研究：使用非干擾試劑和動力學(xué)檢測來研究藥物誘導(dǎo)的治療效果（圖4）
4. 獲得新見解：監(jiān)測96孔板以深入了解腦腫瘤侵襲潛能（圖5）

 

圖1. mTOR抑制劑PP242對 SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型中細(xì)胞健康的影響

圖2. 實(shí)體腦腫瘤3D球模型在生長速度及形態(tài)的變化

圖3. 人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87 3D球模型

圖4. 不同化療藥物的細(xì)胞抑制和細(xì)胞毒性作用

圖5. 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤球狀模型侵襲的高通量分析
 

1. Coordinated Splicing of Regulatory Detained Introns within Oncogenic Transcripts Creates an Exploitable Vulnerability in Malignant Glioma. Cancer Cell 32(4):411-426.e11, 2017
2. Fate mapping of human glioblastoma reveals an invariant stem cell hierarchy. Nature, 549(7671):227-232, 2017
3. Functional diversity and cooperativity between subclonal populations of pediatric glioblastoma and diffuse intrinsic pontine glioma cells. Nat Med 24, 1204–1215 (2018).
4. Selective BCL-XL inhibition promotes apoptosis in combination with MLN8237 in medulloblastoma and pediatric glioblastoma cells. Neuro-Oncology, 20( 2), 203–2018

  神經(jīng)突的生長、成熟以及對神經(jīng)突網(wǎng)絡(luò)的阻斷是研究神經(jīng)疾病病理學(xué)、神經(jīng)元損傷和再生以及篩選神經(jīng)毒性的關(guān)鍵。此外，細(xì)胞活性也是衡量侯選藥物、培養(yǎng)基條件以及環(huán)境因素對神經(jīng)元健康和功能影響的重要指標(biāo)。檢測神經(jīng)細(xì)胞健康可以幫助我們篩選出對神經(jīng)有保護(hù)作用且不會引起神經(jīng)毒性的候選藥物和治療方法。

Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)能夠在長時(shí)間范圍內(nèi)持續(xù)、自動化地對神經(jīng)元健康和形態(tài)的微妙變化進(jìn)行捕捉和量化。兼容96孔板或384孔板，同時(shí)提供高分辨自動化集成軟件和專門設(shè)計(jì)的細(xì)胞無干擾試劑，為細(xì)胞健康分析提供整體解決方案。
 

1. 動態(tài)分析：連續(xù)對每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)動態(tài)分析，獲得比終點(diǎn)法分析更多的數(shù)據(jù)（圖1）；
2. 保護(hù)并節(jié)約寶貴細(xì)胞樣品：使用無標(biāo)記分析和專為神經(jīng)細(xì)胞研究而設(shè)計(jì)的非干擾熒光試劑，減少光毒性并�；畲嗳醯纳窠�(jīng)突（圖2，3，4）；
3. 根據(jù)您的體外模型靈活選擇檢測模式：兼容iPSCs或原代細(xì)胞，適用于單培養(yǎng)和共培養(yǎng)（圖5）；
4. 更快地獲得結(jié)果：高通量、可重復(fù)的數(shù)據(jù)，可對不同通量的孔板進(jìn)行快速藥理分析（圖6）；

 

圖1. 獲得有價(jià)值的ND體外模型生理學(xué)相關(guān)信息

圖2. 在96和384孔板中對神經(jīng)突長度、分支點(diǎn)和胞體進(jìn)行免標(biāo)記、自動化分析

圖3. 使用非干擾熒光試劑對共培養(yǎng)的神經(jīng)突進(jìn)行動態(tài)、長時(shí)間的數(shù)據(jù)采集

圖4. 連續(xù)不間斷地監(jiān)測濃度依賴性對細(xì)胞活性的影響

圖5. 在原代細(xì)胞或iPSC模型來源的神經(jīng)細(xì)胞中檢測神經(jīng)退行性疾病數(shù)據(jù)

圖6. 消耗微量細(xì)胞同時(shí)檢測6塊96孔板或384孔板，自動生成一致性、大容量的數(shù)據(jù)集合
 

1. Imprinted Maternally Expressed microRNAs Antagonize Paternally Driven Gene Programs in Neurons. Mol. Cell, 2020
2. CD49f is a novel marker of functional and reactive human iPSC-derived astrocytes. Neuron, 107(3), 436-453. 2020
3. Transcriptional programming of human mechanosensory neuron subtypes from pluripotent stem cells. Cell reports, 30(3), 932-946. 2020
4. Stem cell-derived neurons reflect features of protein networks, neuropathology, and cognitive outcome of their aged human donors. Neuron.2021

  神經(jīng)免疫學(xué)主要研究神經(jīng)和免疫系統(tǒng)在發(fā)育過程、穩(wěn)態(tài)以及應(yīng)對損傷和感染時(shí)的相互作用。免疫細(xì)胞在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，比如小膠質(zhì)細(xì)胞的突觸修剪是神經(jīng)可塑性的關(guān)鍵部分。損傷、感染或穩(wěn)態(tài)喪失可導(dǎo)致神經(jīng)炎癥或小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，進(jìn)而引發(fā)吞噬死亡或神經(jīng)元和感染源死亡。慢性神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是許多神經(jīng)退行性疾病的根源，小膠質(zhì)細(xì)胞的長期激活對神經(jīng)系統(tǒng)有害。

Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)能夠?qū)π∧z質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行全面的形態(tài)和功能表征。完全自動化的圖像采集有助于獲取可視化的數(shù)據(jù)來分析凋亡神經(jīng)元的小膠質(zhì)細(xì)胞胞葬作用以及生物顆粒吞噬。通過活細(xì)胞趨化遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)量化小膠質(zhì)細(xì)胞在趨化因子作用下的遷移。
 

1. 觀察及驗(yàn)證小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用（圖1）
2. 實(shí)時(shí)定量分析小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用及胞葬作用（圖2，3）
3. 評價(jià)小膠質(zhì)細(xì)胞趨化作用（圖4）
4. 監(jiān)測細(xì)胞分化和激活后的形態(tài)變化（圖5）

 

圖1. 觀察及驗(yàn)證小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用

圖2. 小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用的實(shí)時(shí)定量分析

圖3. 小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬調(diào)節(jié)機(jī)制的評估

圖4. 評估小膠質(zhì)細(xì)胞趨向性遷移

圖5. iPSC來源的單核細(xì)胞（Axol BioScience）分化為小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化
 

1. Methotrexate chemotherapy induces persistent tri-glial dysregulation that underlies chemotherapy-related cognitive impairment. Cell, 2019, 176(1-2): 43-55. e13.
2. RIPK3 restricts viral pathogenesis via cell death-independent neuroinflammation. Cell, 2017, 169(2): 301-313. e11.
3. Glioblastomas acquire myeloid-affiliated transcriptional programs via epigenetic immunoediting to elicit immune evasion. Cell, 2021, 184(9): 2454-2470. e26.
4. CD22 blockade restores homeostatic microglial phagocytosis in ageing brains. Nature, 2019, 568(7751): 187-192.
5. Clearance of senescent glial cells prevents tau-dependent pathology and cognitive decline. Nature, 2018, 562(7728): 578-582.
6. Tissue-resident macrophages provide a pro-tumorigenic niche to early NSCLC cells. Nature, 2021: 1-7.