技術(shù)分享：蛋白質(zhì)組學(xué)常見(jiàn)問(wèn)題與解答

上期的蛋白組學(xué)FAQ文章推出后老師們積極關(guān)注，那么這期再給各位老師整理些經(jīng)常咨詢的問(wèn)題，以供參考。

Q&A
Q1 : 蛋白組一般是建議做多少個(gè)生物學(xué)重復(fù)？
A: 原則上是生物學(xué)重復(fù)越多越好，排除個(gè)體差異，篩選的差異蛋白更準(zhǔn)確，驗(yàn)證成功率更高。考慮到經(jīng)費(fèi)、統(tǒng)計(jì)分析需要及后續(xù)編輯可能會(huì)質(zhì)疑的情況，臨床樣本建議每組十個(gè)重復(fù)以上，其他來(lái)源樣本每組至少三個(gè)重復(fù)。

Q2 : 蛋白組樣本如何寄送？
A: 常規(guī)組織、細(xì)胞、體液等生物樣本需要低溫保存，干冰寄送。膠條樣本可以冰袋寄送。

Q3 :蛋白組學(xué)能否測(cè)未知的蛋白？或者是表達(dá)的外源蛋白，該樣本物種數(shù)據(jù)庫(kù)里沒(méi)有的蛋白能否測(cè)到？
A:蛋白組學(xué)檢測(cè)結(jié)果是與已知的數(shù)據(jù)庫(kù)蛋白進(jìn)行比對(duì)，無(wú)法預(yù)測(cè)未知的蛋白，如果需要檢測(cè)未知蛋白，可采用測(cè)序等其他方法。如果數(shù)據(jù)庫(kù)里不包含關(guān)注的蛋白，那么無(wú)法比對(duì)到�？梢詫㈥P(guān)注的蛋白序列加入到數(shù)據(jù)庫(kù)里作為搜庫(kù)文件進(jìn)行分析。

Q4 :磷酸化蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)的流程？
A:磷酸化蛋白組可以做非標(biāo)記產(chǎn)品，也可以做標(biāo)記產(chǎn)品。目前標(biāo)記產(chǎn)品做的較多，可以增加檢測(cè)深度。實(shí)驗(yàn)流程主要是包括樣本前處理、蛋白的提取、蛋白濃度的測(cè)定和跑膠質(zhì)控、酶解成肽段、修飾肽段的富集、（肽段標(biāo)記）、質(zhì)譜檢測(cè)。方案多樣化，可以進(jìn)行選擇，可以先富集再分級(jí)再檢測(cè)，或者先標(biāo)記、分級(jí)、每級(jí)富集等等。

Q5 :蛋白檢測(cè)結(jié)果較少是為什么呢？
A:首先可能是數(shù)據(jù)庫(kù)比較小的原因，導(dǎo)致檢測(cè)到的結(jié)果比較少�？梢赃x擇擴(kuò)大層級(jí)或者選擇研究較多的近緣物種、模式物種數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜庫(kù)分析。其次看下膠圖，判斷樣本本身?xiàng)l帶是否較少，是否存在高豐度蛋白，高豐度蛋白的存在會(huì)影響檢測(cè)數(shù)量。

Q6 : 鑒定到的蛋白與凝膠電泳圖譜中估測(cè)分子量差異很大的原因？或者為什么SDS-PAGE膠上不同位置條帶的質(zhì)譜鑒定結(jié)果中含有同一個(gè)蛋白？
A: 由于體內(nèi)或者體外因素，導(dǎo)致同一蛋白存在不同形式的修飾、剪切或者降解，從而形成凝膠電泳圖中能夠看到的存在差異分子量的蛋白條帶。然而這些蛋白在質(zhì)譜鑒定時(shí)會(huì)同時(shí)指向數(shù)據(jù)庫(kù)中同一個(gè)、全長(zhǎng)的、無(wú)修飾的蛋白理論序列。因此會(huì)出現(xiàn)凝膠電泳圖中的蛋白分子量（實(shí)際分子量）與鑒定的蛋白分子量（理論分子量）不同的情況。

Q7 : 差異蛋白如何篩選？
A: 差異蛋白篩選的條件主要是結(jié)合T檢驗(yàn)的p值和FC值，一般標(biāo)記產(chǎn)品按照FC>1.2 or FC<0.83,p<0.05;非標(biāo)記產(chǎn)品按照FC>1.5 or FC<0.67,p<0.05進(jìn)行篩選。實(shí)際過(guò)程中也會(huì)結(jié)合檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行放寬或者卡嚴(yán)，一般控制在檢測(cè)結(jié)果20%以內(nèi)，5-10%為佳。

Q8 : 做完蛋白組學(xué)，選用何種方法驗(yàn)證呢？
A: 常規(guī)蛋白驗(yàn)證方法主要包括WB、ELISA、PRM。如果關(guān)注的蛋白數(shù)量不多且有對(duì)應(yīng)的商品化檢測(cè)試劑盒或者抗體，建議選擇ELISA或WB方法進(jìn)行驗(yàn)證，此方法更為成熟。如果關(guān)注的蛋白數(shù)量較多，也沒(méi)有商品化的抗體，建議選用PRM的方法。經(jīng)費(fèi)充裕的情況下，抗體制備也是一個(gè)不錯(cuò)的選擇。

Q9 : 通過(guò)western blot檢測(cè)到的蛋白，為什么質(zhì)譜沒(méi)有檢測(cè)到或者只檢測(cè)到一個(gè)肽段？
A: Western blot 檢測(cè)是將目的蛋白信號(hào)放大很多級(jí)之后進(jìn)行檢測(cè)的，靈敏度很高，（除非特異性結(jié)合之外）幾乎不受復(fù)雜樣品中背景蛋白豐度的影響。質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)樣品中豐度較高的蛋白優(yōu)先、多次被檢測(cè)到，而豐度較低的蛋白則因?yàn)殡亩涡盘?hào)過(guò)弱被淹沒(méi)而不能被檢測(cè)到。因此，如果樣品中待檢測(cè)的目標(biāo)蛋白豐度較低，即使WB能夠檢測(cè)到，質(zhì)譜并不一定能檢測(cè)到或者僅能檢測(cè)到較少的肽段數(shù)。

Q10 : 同一批樣本，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下調(diào)，但是蛋白組學(xué)結(jié)果上調(diào)，這種是什么情況？
A: 這是正常的現(xiàn)象，上下游不是一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，常規(guī)mRNA與蛋白質(zhì)間的相關(guān)系數(shù)僅為0.4~0.5。一個(gè)蛋白的表達(dá)受到很多因素的控制，除了這個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的mRNA之外，還有比如轉(zhuǎn)錄因子，增強(qiáng)子，抑制子，DNA和RNA的修飾作用等等。

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