黑木耳多糖對(duì)高脂飲食和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的降糖作用

文章標(biāo)題：Hypoglycemic effects of Auricularia auricula polysaccharides on high fat diet and streptozotocin-induced diabetic mice using metabolomics analysis

發(fā)表期刊：Food&Function

發(fā)表時(shí)間：2021年10月

影響因子：5.396

合作客戶：陜西科技大學(xué)，渭南師范學(xué)院

研究背景
糖尿病(DM)是一種由糖脂代謝紊亂引起的慢性高血糖為特征的代謝性疾病。據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會(huì)報(bào)告，2020年全球有4.6億人受到糖尿病的影響，使糖尿病成為繼癌癥和心血管疾病之后威脅人類健康的第三大慢性疾病。糖尿病患者中2型糖尿病占糖尿病病例的90%。不健康的飲食習(xí)慣、肥胖和遺傳是T2DM的主要誘因，最終導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能受損。目前，糖尿病治療主要是長(zhǎng)期注射外源性胰島素和口服降糖藥物，包括磺酰脲類、雙胍類等，并輔以飲食控制和適當(dāng)運(yùn)動(dòng)來維持血糖水平。這些藥物存在一定的負(fù)面作用，所以急需尋找其他低毒、高效的降糖方法來輔助糖尿病治療或緩解其癥狀。

研究思路及結(jié)果
本文利用代謝組學(xué)分析闡述黑木耳多糖(AAPs)對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的2型糖尿病(T2DM)小鼠的降糖作用。通過對(duì)小鼠的空腹血糖、口服糖耐量試驗(yàn)、空腹血清胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)、TC、TG、HDL-C、LDL-C及組織病理學(xué)觀察記錄，并使用AAP處理小鼠，對(duì)處理前后小鼠的血清中差異代謝物進(jìn)行分析。結(jié)果闡明了AAPs在緩解T2DM中的代謝途徑，為開發(fā)治療T2DM的功能性食品佐劑提供了指導(dǎo)。

1.AAPs對(duì)小鼠體重、攝食量和飲水量的影響
通過對(duì)各組小鼠的體重變化趨勢(shì)觀察分析，試驗(yàn)前各組間無顯著差異(P> 0.05)，在HFD開始后除了NC組外，各組體重迅速增加。體重減輕是糖尿病的典型癥狀，T2DM小鼠在干預(yù)期間體重逐漸下降(超過6-10周)，相應(yīng)的體重下降了近20%。但是在AAP和二甲雙.胍的干預(yù)下，T2DM小鼠的體重保持穩(wěn)定。最終AAP-M組小鼠的體重顯著高于MD組(P< 0.05)。在成功誘導(dǎo)2型糖尿病后，T2DM小鼠出現(xiàn)更多的飲食癥狀，特別是糖尿病小鼠的飲水量顯著高于正常小鼠(P< 0.01)。AAP干預(yù)后，小鼠的平均飲食量和飲水量均有不同程度的下降。

2.AAPs對(duì)FBG水平和OGTT值的影響
空腹及餐后血糖升高是糖尿病診斷的主要標(biāo)準(zhǔn)。在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，各組FBG初始水平均在正常范圍內(nèi)，STZ誘導(dǎo)后的T2DM小鼠FBG水平顯著高于11.1 mmol L−1(P< 0.01)，提示高血糖模型建立成功。在AAP和二甲雙.胍干預(yù)第5周，小鼠的NC和AAP治療組的FBG水平顯著低于MD組(P< 0.01)，AAP-M組降糖效果最佳，較AAP-L、AAP-H、PC組降糖效果顯著降低42% (P< 0.01)。

口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)廣泛應(yīng)用于糖尿病的診斷。正常和T2DM小鼠在口服2.0g/kg b.w葡萄糖30min后，所有小鼠的血糖均達(dá)到最大值，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組血糖均逐漸降低。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，正常小鼠的血糖水平明顯低于T2DM小鼠(P< 0.01)。這是由于stz誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞損傷，導(dǎo)致血糖調(diào)節(jié)能力嚴(yán)重不足。AAP-M組在120min時(shí)血糖水平為14.17±1.56 mmol L−1，顯著低于其他各組(P< 0.01)。因此，補(bǔ)充AAP可能會(huì)加速葡萄糖的消耗速度，從而產(chǎn)生降低血糖的效果。

3.AAPs對(duì)FINS水平、胰島素抵抗指數(shù)穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估和血脂水平的影響
胰島素是由胰島β細(xì)胞分泌的一種激素，具有降低血糖的作用，是臨床診斷和分型的參考指標(biāo)。圖1中分別顯示了每組小鼠的FINS水平和穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)值，MD組FINS水平和HOMA-IR值均顯著高于NC組(P< 0.01)。治療5周后，與MD組相比，各治療組FINS水平和HOMA-IR值均顯著降低(P< 0.01)。

血清胰島素水平升高在早期T2DM患者中非常常見。因此，AAPs對(duì)T2DM小鼠胰島素拮抗具有一定的保護(hù)作用。流行病學(xué)研究表明，DM常伴有血脂異常，主要表現(xiàn)為TC、TG、LDL-C升高，HDL-C水平降低。如圖1所示，與NC組比較，MD組TC、TG、LDL-C水平顯著升高(P< 0.01)， HDL-C水平顯著降低(P< 0.01)。AAP組和二甲雙.胍組小鼠的TC、TG、LDL-C水平均高于正常組，進(jìn)一步證實(shí)T2DM小鼠血脂水平異常。AAP-L、PC組TG、TC顯著低于MD組(P< 0.05)。因此，服用AAPs或二甲雙.胍可以緩解TG和TC的升高。目前，血脂異常對(duì)T2DM病程的影響仍存在爭(zhēng)議。尼日利亞的一項(xiàng)研究表明，糖尿病持續(xù)時(shí)間和血脂異常之間沒有顯著相關(guān)性(P> 0.05)。這些結(jié)果與當(dāng)前結(jié)果之間的差異可能是由于血糖控制和使用的樣本量、環(huán)境影響以及其他方面的差異造成的。
 

圖1. AAPs對(duì)(A) FINS、(B) HOMA-IR、(C) TG、(D) TC、(E) HDL-C和(F) LDL-C水平的影響

4.AAPs對(duì)胰腺和肝臟組織病理學(xué)的影響
各組胰腺組織學(xué)變化見圖2A-F。NC組胰島細(xì)胞正常，細(xì)胞核清晰圓形，薄層纖維組織包膜相對(duì)完整，分葉狀清晰，無增厚。未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、增殖等明顯病理改變(圖2A)。MD組胰島萎縮，形態(tài)不規(guī)則，部分胰島細(xì)胞變性、壞死、空泡化;也觀察到核固縮或溶解(圖2B)。AAP和二甲雙.胍可不同程度地修復(fù)胰腺組織損傷(圖2C-F)。AAP-M和AAP-H組修復(fù)效果最明顯:胰島細(xì)胞形態(tài)相對(duì)正常(細(xì)胞核清晰，橢圓形規(guī)則)，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和增殖(圖2D和E)。

肝細(xì)胞病理觀察如圖2a-f所示。NC組肝索排列整齊，中心靜脈內(nèi)皮細(xì)胞完整，肝細(xì)胞形態(tài)正常。肝細(xì)胞及小膽管內(nèi)未見膽汁淤積，膽管結(jié)構(gòu)完整清晰，無明顯脂滴及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2a)。與此相反，MD組肝細(xì)胞胞漿中可見許多未染色的圓形脂滴;此外，肝細(xì)胞核腫脹，證實(shí)HFD導(dǎo)致部分肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性(圖2b)。在不同的治療組中，肝臟病變的數(shù)量顯著減少。然而，在PC組(圖2f)、AAP-L組(圖2c)和AAP-H組(圖2e)中，個(gè)別單個(gè)肝細(xì)胞胞漿中偶見空泡或脂滴。AAP-M組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，與NC組小鼠相似(圖2d)。這些結(jié)果表明AAP (200mg/kg b.w)可以緩解T2DM引起的內(nèi)臟病變。
 

圖2. AAPs對(duì)胰腺和肝臟組織病理影響

5.非靶向血清代謝組學(xué)分析
基于上述結(jié)果，AAP-M組改善緩解效果相對(duì)較好，選擇NC和MD為研究對(duì)象，通過UHPLC-QE HFX-MS技術(shù)進(jìn)行代謝物檢測(cè)分析進(jìn)一步探討AAP對(duì)T2DM代謝通路的積極作用。在血清樣本POS和NEG離子模式下的PCA圖中，MD和AAP-M組均與NC組明顯分離，表明T2DM模型建立成功（圖3A-B）。因此，AAP給藥200mg/kg b.w后小鼠的代謝物與MD組有顯著差異。由于代謝數(shù)據(jù)具有復(fù)雜的多維特性，單靠無監(jiān)督PCA模型分析無法很好地區(qū)分樣本間的組間差異。因此，使用OPLS-DA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，OPLS-DA得分圖顯示MD組和NC組在兩種模式下的代謝譜明顯分離,置換檢驗(yàn)表明模型穩(wěn)定可靠(圖3)。PCA和OPLS-DA結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了我們STZ誘導(dǎo)T2DM小鼠模型的成功建立，AAP-M給藥可以調(diào)節(jié)小鼠的代謝譜。
 

圖3. POS和NEG離子模式的PCA和OPLS-DA
 

為了研究?jī)山M之間潛在的生物標(biāo)志物，根據(jù)VIP>1且p<0.05篩選差異代謝物，火山圖中，紅色代表代謝物上調(diào)，藍(lán)色代表代謝物下調(diào)。在MD組和NC組之間，共鑒定出134種代謝物，其中POS和NEG離子模式的代謝物分別為69和65種。在AAP-M和MD組之間，鑒定了179個(gè)代謝物，其中包括101個(gè)和78個(gè)在POS和NEG離子模式下的代謝物。據(jù)此篩選出45種最有可能成為潛在生物標(biāo)志物的物質(zhì)，代謝物水平較高的MD組比NC組包括膽固醇、L-gulose, dihydrothymine等，相比之下,低水平的MD組比NC組包括indole-3-carbi-nol,L-aspartic acid等。
 

圖4. UHPLC-QE HFX-MS技術(shù)檢測(cè)血清中的代謝物變化

基于以上篩選的45種差異代謝物，對(duì)潛在的代謝途徑進(jìn)行分析。利用KEGG數(shù)據(jù)進(jìn)行通路富集分析，繪制代謝通路的氣泡圖(圖5)，以探索AAP緩解T2DM最相關(guān)的通路及可能的機(jī)制。AAP-M處理可調(diào)控5個(gè)潛在代謝途徑:精氨酸和脯氨酸代謝、氨基酰- trna生物合成(氨基酸代謝)、不飽和脂肪酸生物合成(脂質(zhì)代謝)、甘油磷脂代謝和初級(jí)膽紅酸(BA)合成。圖5顯示了這些途徑之間的關(guān)系以及在AAPs影響下相關(guān)代謝物的變化。綜上所示，AAP-M組與MD組相比具有獨(dú)特的代謝途徑。
 

圖5. 代謝通路的氣泡圖及相關(guān)途徑代謝物變化

研究結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)研究了AAPs對(duì)STZ誘導(dǎo)的T2DM小鼠的降糖作用。血清代謝組學(xué)分析表明，AAPs通過恢復(fù)氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、BA合成和甘油磷脂途徑，顯著改善胰島素拮抗作用。為AAPs輔助治療2型糖尿病提供了可能，給降糖功能食品的設(shè)計(jì)和生產(chǎn)提供了理論支持。

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