利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行臨床癌癥蛋白質(zhì)組學(xué)研究

臨床樣品的制備方法
對(duì)于臨床組織研究，為了保證從手術(shù)切除到蛋白質(zhì)酶解過(guò)程中的蛋白質(zhì)量，正確的保存方式非常關(guān)鍵。有幾種方法可以選擇：新鮮冷凍（FF）、福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）和OCT包埋。FF與FFPE相比可檢測(cè)到更多的蛋白質(zhì)，但現(xiàn)有的FFPE已經(jīng)儲(chǔ)存了幾年甚至十幾年，是臨床隨訪等回顧性研究的重要樣品來(lái)源。雖然組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究可探究生物機(jī)制信息，但臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究以發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物為主要目標(biāo)，因此“體液”樣品如血液（血清、血漿）、尿液、唾液、淚液和腦脊液等是較為理想的樣品形式，還可用于檢測(cè)癌癥和治療反應(yīng)發(fā)展的縱向研究中。當(dāng)臨床樣品質(zhì)量不足以支持研究時(shí)，可考慮使用模型系統(tǒng)如轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型、癌細(xì)胞系、異種移植模型（CDX、PDX）、類器官等。

蛋白質(zhì)組樣品制備沒(méi)有統(tǒng)一的方案，要根據(jù)樣品復(fù)雜性、樣品量和研究目的選擇合適的方法并優(yōu)化。制備的主要方法有FASP、MStern、S-trap、SP3和iST等。這里以FASP為例進(jìn)行介紹。FASP，即過(guò)濾器輔助的樣品制備法，首先使用陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解蛋白質(zhì)，然后使用分子量（MW）過(guò)濾將蛋白質(zhì)結(jié)合到硝酸纖維素過(guò)濾器上，而較低MW的物質(zhì)則被過(guò)濾掉，連續(xù)的尿素洗滌有助于更好地去除SDS，最后是過(guò)濾器上的蛋白酶解和洗脫獲得多肽產(chǎn)物。

MS檢測(cè)原理及流程
為了在檢測(cè)時(shí)增加蛋白質(zhì)組的覆蓋率，肽段樣品首先通過(guò)反相液相色譜等方法分成不同餾分后進(jìn)入MS分析。利用軟電離技術(shù)（ESI或MALDI）對(duì)肽段進(jìn)行離子化，霧化的多肽可以通過(guò)離子遷移率進(jìn)一步分離，從而降低一級(jí)質(zhì)譜（MS1）的復(fù)雜性和二級(jí)質(zhì)譜（MS2）的污染，并最終實(shí)現(xiàn)更大的蛋白質(zhì)組覆蓋率。這樣的技術(shù)包括離子淌度（TIMS）和高強(qiáng)場(chǎng)離子遷移譜和（FAIMS）。在質(zhì)譜掃描模式的選擇上，傳統(tǒng)的數(shù)據(jù)依賴采集（DDA）模式在蛋白質(zhì)組學(xué)研究非常成熟，且兼容基于標(biāo)簽的定量技術(shù)。在DDA中，MS1掃描結(jié)果中信號(hào)最強(qiáng)的前n個(gè)母離子才會(huì)被選擇并進(jìn)行順序碎裂和MS2檢測(cè)。但是，這種模式的檢測(cè)重復(fù)性差，且存在MS1中高豐度肽影響低豐度肽檢出的問(wèn)題。由于DDA的缺點(diǎn)，蛋白質(zhì)組學(xué)研究開(kāi)始傾向于使用數(shù)據(jù)非依賴采集（DIA）模式。在該模式下，在多個(gè)小范圍的質(zhì)荷比窗口中的所有母離子順序碎裂產(chǎn)生更復(fù)雜的MS2結(jié)果。然后將這些結(jié)果與預(yù)先定義好的譜圖庫(kù)進(jìn)行匹配，通過(guò)大范圍的肽分級(jí)達(dá)到最大的蛋白質(zhì)組深度。

臨床腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)策略

蛋白定量檢測(cè)方法
蛋白定量檢測(cè)技術(shù)多種多樣，按照檢測(cè)范圍可分為靶向與非靶向技術(shù)，也可按照定量方式分為相對(duì)定量或絕對(duì)定量技術(shù)。其中，相對(duì)定量技術(shù)又可分為標(biāo)記技術(shù)（TMT和iTRAQ）和非標(biāo)記技術(shù)（label-free、DIA）。標(biāo)記相對(duì)定量技術(shù)中TMT標(biāo)簽可增加樣品通量到16個(gè)。然而， TMT方法需要多級(jí)的肽分級(jí)來(lái)獲得深入的蛋白質(zhì)組圖譜，并且1-2個(gè)TMT通道常用于檢測(cè)所有樣品的混樣來(lái)減少批間差，這降低了各個(gè)項(xiàng)目之間進(jìn)行有效比較的能力，并增加檢測(cè)成本。而label-free技術(shù)，得益于數(shù)據(jù)分析軟件的發(fā)展，可以從MS1的肽離子峰分?jǐn)?shù)計(jì)算出蛋白質(zhì)的相對(duì)豐度。與標(biāo)記技術(shù)相比，非標(biāo)記技術(shù)具有更寬廣的動(dòng)態(tài)范圍，但精準(zhǔn)度會(huì)稍差一些。因此，對(duì)于患者間和患者內(nèi)存在較大蛋白質(zhì)表達(dá)差異的臨床樣品，label-free定量技術(shù)更適合鑒定出更多的差異表達(dá)蛋白。

通過(guò)非靶向相對(duì)定量檢測(cè)技術(shù)篩選到的目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證，如基于抗體的ELISA和基于MS的靶向分析技術(shù)。其中，基于MS的靶向定量技術(shù)有多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）和平行反應(yīng)檢測(cè)（PRM）兩種。MRM使用三重四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，需要先確定目標(biāo)母離子和碎片離子的質(zhì)荷比，由四極桿選擇母離子和3-5個(gè)相關(guān)碎片離子的組合并進(jìn)行定量分析。而PRM利用高分辨率質(zhì)譜提高特異性。PRM中所有碎片離子都是在分析中生成并被記錄，所以只需要確定目標(biāo)母離子的質(zhì)荷比并直接從二級(jí)質(zhì)譜中選擇最好的碎片離子即可進(jìn)行定量分析。如果加入用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的肽標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照，這兩種靶向技術(shù)可達(dá)到絕對(duì)定量水平。兩種技術(shù)相比，PRM能可靠地監(jiān)測(cè)更多的靶點(diǎn)。

臨床蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用方向
在腫瘤學(xué)研究中，組織分析能夠最準(zhǔn)確地反映腫瘤的生理狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物、生物學(xué)通路，并與現(xiàn)有的基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果整合做多組學(xué)分析。這類研究通常使用同一患者的癌組織樣品和癌旁“健康”對(duì)照樣品比較尋找潛在的診斷biomarker。同時(shí)，對(duì)不同癌癥分期患者比較獲得預(yù)后信息。當(dāng)鑒定到較少數(shù)量的候選蛋白后，就可以利用通路分析深入了解這些蛋白是如何與腫瘤發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移和其他癌癥驅(qū)動(dòng)過(guò)程相關(guān)的，隨后在獨(dú)立大隊(duì)列樣品中補(bǔ)充差異表達(dá)蛋白的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)�？偨Y(jié)目前科研現(xiàn)狀，癌癥蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方向主要有尋找風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、癌癥分級(jí)和預(yù)后的標(biāo)志物、確認(rèn)有效的治療靶點(diǎn)和翻譯后修飾如磷酸化、乙�；�、糖基化等。此外，腫瘤異質(zhì)性問(wèn)題對(duì)單細(xì)胞水平的蛋白質(zhì)研究提出了要求�；�于質(zhì)譜的質(zhì)譜流式技術(shù)可以在單個(gè)細(xì)胞中監(jiān)測(cè)幾十個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)志物，將抗體探針和獨(dú)特的重金屬同位素連接在一起后與細(xì)胞孵育，然后細(xì)胞被感應(yīng)耦合等離子體(ICP)霧化，金屬離子向質(zhì)譜儀提供目標(biāo)蛋白在樣本中的定量讀數(shù)。


2019年10月在《Cell》上發(fā)表的“Integrated Proteogenomic Characterization of HBV-Related Hepatocellular Carcinoma”一文中，作者利用多組學(xué)研究思路，對(duì)159位感染乙型肝炎病毒的肝細(xì)胞癌患者的配對(duì)癌組織和癌旁肝組織進(jìn)行了基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和磷酸化蛋白質(zhì)組研究，發(fā)現(xiàn)了代謝改變對(duì)肝癌晚期發(fā)展和不良預(yù)后的影響，并對(duì)肝細(xì)胞癌進(jìn)行了蛋白層面的精準(zhǔn)分型，為個(gè)性化靶向治療提供了新策略。

臨床蛋白質(zhì)組學(xué)的研究前景
隨著標(biāo)準(zhǔn)化、高通量的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，臨床研究將向著更大隊(duì)列的方向進(jìn)步，這將使蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并提高蛋白標(biāo)志物和藥物靶點(diǎn)臨床轉(zhuǎn)化的效率。另一方面，蛋白質(zhì)組學(xué)將通過(guò)集成基因組學(xué)、表觀基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和翻譯后修飾組學(xué)等多組學(xué)數(shù)據(jù)，成為癌癥系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。

參考文獻(xiàn)
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