人血清中Fn14超高靈敏度單分子檢測方法的建立
Simoa單分子免疫陣列分析技術是目前市面上最靈敏的蛋白分子檢測技術，其可以檢測單個蛋白分子，靈敏度達到飛克級別。在腫瘤、神經(jīng)、感染免疫、心血管、炎癥、生殖、眼科等領域都有著廣泛應用。Simoa平臺是一個開放的研究平臺，除現(xiàn)有的商品化試劑盒之外，各領域的研究人員都可自行進行方法開發(fā)及分析。
今天給大家分享的這篇文章發(fā)表于ANAL BIOCHEM上，本文詳細介紹了homebrew 的開發(fā)過程，包括原理介紹、抗體選擇、磁珠包被、特異性分析、回收率的計算等，是一篇關于Homebrew開發(fā)的經(jīng)典文獻。
摘 要
受體蛋白Fn14是腫瘤壞死因子（TNF）超家族中的最小成員，在一些疾病中，如癌癥、自身免疫性疾病、腎臟疾病等中會過度表達，因此常被作為蛋白生物標記物用來監(jiān)測和指示生理和病理進展。來自湖南大學的研究者們基于Simoa平臺，開發(fā)了一種用于檢測Fn14的超靈敏分析法。他們共篩選了44對不同的抗體對，試劑盒的檢測范圍為1.26 pg/mL~3683 pg/mL，檢測下限為0.32 pg/mL，遠低于市售的傳統(tǒng)ELISA試劑盒，且分析全程自動化，只需大約一個小時即可完成。
圖1. 基于Simoa的Fn14檢測原理
首先，將Fn14捕獲抗體包被在磁珠上，并與靶蛋白形成夾心免疫復合物，然后用SβG標記珠子。最后，將珠子推入到光盤的微孔中并與RGP熒光底物反應。由于微孔非常小，能檢測到單個酶分子的存在，所以反應的靈敏度非常高。通過計算微孔中每個磁珠結合的平均酶數(shù)（AEB）來檢測Fn14蛋白質的濃度。
實驗方法
圖2. Fn14抗體對的檢測可行性研究
本文對10種抗體（5種單克隆抗體和5種多克隆抗體）進行了配對篩選。通過ELISA從44個抗體對組合中篩選出2對結果最好的組合，在Simoa平臺上進行驗證，如圖所示，m5+m2抗體對結果令人滿意。
所用抗體對和標準品信息
圖3. 兩步法和三步法的優(yōu)化比對
經(jīng)過優(yōu)化比對，確定了分析方法為兩步法，檢測抗體濃度為0.28μg/mL，SBG濃度為300pm。
圖4. Fn14試劑盒的標準品檢測曲線
表1. Simoa試劑盒與傳統(tǒng)ELISA試劑盒的性能比較
結果顯示Simoa試劑盒無論是檢測范圍還是LOD都遠優(yōu)于傳統(tǒng)的ELISA試劑盒。
圖5. 試劑盒的特異性檢測
在樣本中加入CRP、IL-6、IL-8、p53、FGF2和FGF21等物質作為干擾蛋白（每種濃度為10ng/mL，F(xiàn)n14為100pg/mL）來進行檢測，如圖所示，試劑盒對Fn14的特異性非常高。
圖6. 人血清樣品中Fn14的稀釋線性
將健康人血清按照1:2、1:4、1:6和1:8進行稀釋（x軸上分別表示為0.5、0.25、0.167和0.125）后進行測試，如圖顯示出良好的線性關系。
表2. 三種加標濃度下Fn14的回收率
將未知濃度的血清樣品稀釋4倍并分成四等份，再分別加入0、10、50、200 pg/mL的 Fn14重組蛋白。其回收率在85.4%～120.7%之間，表明該檢測方法在人血清中的準確性和可靠性非常好。注：CDet是加標后樣品中Fn14的測量濃度，CSpike是添加到樣品中的重組蛋白的濃度。
結 論
本研究開發(fā)了一種超靈敏的Simoa Fn14檢測方法，該方法在血清樣本中具有良好的特異性和適用性。其LOD為0.32pg/mL，大大低于常規(guī)免疫檢測方法；動態(tài)范圍寬，即使在極低濃度下也可用于準確檢測血清Fn14。
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