甘氨酸營養(yǎng)缺陷性表皮葡萄球菌突變株釋放的細胞外DNA促進導管感染

文章標題：Extracellular DNA released by glycine-auxotrophic Staphylococcus epidermidis small colony variant facilitates catheter-related infections

發(fā)表期刊：Communications Biology
發(fā)表時間：2021年4月
影響因子：6.268
合作客戶：上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院
 

  研究背景

小菌落突變株(SCV)是一種具有獨特表型及致病特征且生長緩慢的細菌亞群，目前已發(fā)現(xiàn)SCV與植入性相關的葡萄球菌感染有著明確聯(lián)系。由于長期以來導管和許多其他類型的植入性醫(yī)療器械引起的感染，被認為是危及生命的醫(yī)院膿毒癥的主要來源，目前迫切需要闡明SCV在導管相關感染發(fā)生中的作用機制。

本課題使用基因組學和代謝組學等技術，通過對臨床典型的表皮葡萄球菌病例分析（包括穩(wěn)定型SCV、正常表皮葡萄球菌NC和不穩(wěn)定型SCV），研究SCV在導管感染中的潛在機制，以及分析生物膜的形成和甘氨酸對細胞生長、肽聚糖連接率的影響。

研究結果表明，表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV的突變影響到了各種代謝過程。由于能夠快速自溶并且釋放eDNA，SCV表現(xiàn)出更強的生物膜形成能力。當SCV與NC共同感染時，SCV可以促進NC的體外生物膜形成和體內存活。本課題為甘氨酸營養(yǎng)缺陷型表皮葡萄球菌SCV在持續(xù)性感染中的作用提供了新的思路。

 

研究結果 

1.在表皮葡萄球菌為主的導管感染中SCV呈現(xiàn)高流行率
在128例導管感染病例中，葡萄球菌占總病例的39.1%，其中表皮葡萄球菌占比最為突出，而革蘭氏陰性桿菌、棒狀桿菌和腸球菌分別僅占18.0%、4.7%和3.9% (圖1a)。21.9%的導管感染是由多物種共同感染，且多數(shù)是和表皮葡萄球菌相關（14/28,50%），這進一步證明了表皮葡萄球菌在導管感染中起到重要作用(圖1a)。

在同一葡萄球菌感染病例中，SCV通常伴隨著正常型NC一同出現(xiàn)(41/50,82%)（圖1b）。然而大多數(shù)SCV的表型并不穩(wěn)定，在傳代培養(yǎng)后很容易恢復成正常大小的菌落（Rev）。因此50個案例中只有8個是穩(wěn)定型的SCV。
 

圖1. 從臨床病例中收集SCV

2.表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV具有更強的生物膜形成能力
表型分析顯示，穩(wěn)定型SCV的生物膜形成能力比NC更強（圖2a）。此外，在穩(wěn)定型SCV中也觀察到了侵入人類A549細胞和附著于非生物聚苯乙烯表面的能力（圖2b、c），而表皮葡萄球菌 Rev表現(xiàn)出與NC相同的表型。由于細菌附著能力與其理化性質密切相關，實驗發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定型SCV的zeta電位比NC更偏陽性。因此穩(wěn)定型SCV的附著能力增加可能是細菌和帶負電荷的基質之間排斥力降低所致。
 

圖2. 表皮葡萄球菌穩(wěn)定型 SCV的表型改變

3.表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV的基因突變和相關代謝紊亂涉及到了廣泛的細胞代謝過程
全基因組測序覆蓋了表皮葡萄球菌126個基因，其中61個基因是穩(wěn)定型SCV獨有的， NC和Rev只有細微的差異（圖3a）。KEGG通路分析結果注釋到了廣泛的關鍵代謝過程，從丙酮酸代謝、檸檬酸循環(huán)到嘧啶代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝（圖3b）。此外，存在多個與生物素合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝相關的基因，進一步暗示穩(wěn)定型 SCV 中的代謝途徑可能會受到這些突變的干擾。

代謝分析的PCA結果表明（圖 3c），表皮葡萄球菌NC和穩(wěn)定型SCV兩組明顯分開，表明穩(wěn)定型SCV的代謝水平上發(fā)生了顯著變化。篩選出的39種差異代謝物（DEM）中，28種在表皮葡萄球菌穩(wěn)定SCV中上調，11種下調（圖3d），其中氨基酸及其衍生物占大部分（16/39，41%），其次是核苷酸及其類似物（9/39，23%）。而葡萄球菌細胞壁五肽交聯(lián)橋的主要成分甘氨酸的含量顯著降低，此外丙酮酸和乙酰輔酶A的含量也顯著上調。

STITCH的關聯(lián)網(wǎng)絡證明移碼突變有可能對相關代謝物產(chǎn)生巨大影響。在圖中（圖3e），甘氨酸的濃度異常降低而大多數(shù)DEM的濃度增加，與移碼 SERP1287基因相互關聯(lián)，其產(chǎn)物是催化甘氨酸合成的丙氨酸-乙醛酸氨基轉移酶（AGXT1）。此外，該網(wǎng)絡還暗示乙酰輔酶A水平的急劇增加可能歸因于odhA和accA的突變（圖3e），這兩者都催化了乙酰輔酶A的下游分解反應。由于乙酰輔酶A對丙酮酸脫氫酶復合物的抑制作用，丙酮酸可能因此積累。
 

圖3. 表皮葡萄球菌穩(wěn)定型 SCV 的基因組學分析和代謝組學分析

4.功能失調的甘氨酸生物合成是導致表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV生長緩慢的原因
基因組學和代謝組學分析表明，表皮葡萄球菌穩(wěn)定SCV的緩慢生長可能是由于甘氨酸短缺造成的。在革蘭氏陽性葡萄球菌中，甘氨酸也是肽聚糖交聯(lián)橋的組成部分，其缺乏會阻止肽聚糖交聯(lián)，從而降低細胞壁的構建速度。

在培養(yǎng)基中添加外源甘氨酸能夠使穩(wěn)定型SCV生長明顯改善，接近正常表皮葡萄球菌NC，而甘氨酸對NC生長的影響很小（圖4a），這表明分離到的SCV是甘氨酸營養(yǎng)缺陷型SCV。通過帶有TAMRA 的熒光標記的D-氨基酸 (FDAA) 來確定表皮葡萄球菌NC和穩(wěn)定型SCV的肽聚糖連接率，結果表明在相同的標記時間（30 分鐘）內，穩(wěn)定型SCV產(chǎn)生的TAMRA信號比NC顯著減少，說明了其肽聚糖連接速率要慢得多（圖4b）。

補充甘氨酸可以將TAMRA 信號恢復到與NC 相同的水平，但對NC沒有影響，表明甘氨酸短缺確實通過降低肽聚糖連接率對穩(wěn)定型SCV生長產(chǎn)生負面影響。
 

圖4. 外源性甘氨酸對表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV生長和肽聚糖連接率的影響

5.表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV釋放的細胞外DNA(eDNA)能夠促進生物膜的形成
使用共聚焦激光掃描顯微鏡成像觀察生物膜含量（圖5a），SCV具有顯著更高的生物膜生物量和平均生物膜厚度（圖5b）。通過從穩(wěn)定型SCV形成生物膜中提取eDNA進行半定量分析，進一步證實了穩(wěn)定型SCV可通過促進細胞內DNA的釋放來影響生物膜基質的組成，尤其是高分子量eDNA（圖5c）。然而如 Alexa Fluor 350 偶聯(lián)小麥胚芽凝集素 (WGA) 和半定量的熒光信號所反映的，表皮葡萄球菌的主要生物膜基質PIA沒有顯著變化（圖5d)。

此外，穩(wěn)定型SCV與 NC在蛋白酶 K 處理后的生物膜生物量下降相似，而在用 DNase I 處理后，穩(wěn)定型SCV的生物膜生物量下降幅度顯著大于NC（圖5e），進一步說明eDNA 釋放直接增強了表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV的生物膜形成。
 

圖5. 細胞外 DNA (eDNA) 釋放的增加促進了表皮葡萄球菌穩(wěn)定 SCV 的生物膜形成
 

6.穩(wěn)定型SCV可促進導管相關感染的物種共同生存
盡管細胞活力下降，表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV能夠提供生存優(yōu)勢，使整個群體受益。在初始接種劑量下，穩(wěn)定的SCV對體外NC生物膜形成的影響相當顯著（圖 6a）。當穩(wěn)定型SCV 和 NC 在小鼠導管感染模型中共感染時，從植入的導管和周圍組織中回收的細菌 CFU 顯著高于穩(wěn)定型SCV 或NC獨立感染時的數(shù)量（圖 6b）。
 

圖6.表皮葡萄球菌穩(wěn)定型 SCV 亞群的有益作用

 結 論

生物膜的形成是導管感染以及許多其他類型的異物感染的發(fā)生和發(fā)展的關鍵過程，本文研究了甘氨酸營養(yǎng)缺陷型表皮葡萄球菌穩(wěn)定型SCV感染的機制，說明了感染過程中伴隨著基因組變異和代謝功能障礙。而且穩(wěn)定型SCV和NC可以協(xié)同作用，促進生物膜相關導管感染的發(fā)生和持續(xù)存在。盡管如此，臨床表皮葡萄球菌SCV的突變和代謝譜的復雜性以及病理機制的多樣性表明，表皮葡萄球菌SCV仍需要更深入的研究。

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