間充質(zhì)干細胞的成脂誘導(dǎo)分化實操指南
在大多數(shù)干細胞實驗研究中，誘導(dǎo)分化成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞已經(jīng)成為鑒定其分化潛能的金標準。
上期我們分享了成骨誘導(dǎo)分化的操作（點這里回顧），本期輪到成脂誘導(dǎo)分化操作啦！
成脂誘導(dǎo)分化
脂肪組織由脂肪細胞組成，對保持能量和代謝平衡非常重要。脂肪組織有兩種，一種為白色脂肪組織（WAT），主要分布在皮下和內(nèi)臟，內(nèi)臟白色脂肪與肥胖、病理驗證和胰島素抵抗相關(guān)，皮下白色脂肪則可提高葡萄糖耐受性；另一種為棕色脂肪組織（BAT），主要呈離散狀分布在脊椎旁、鎖骨和腎上腺，功能是產(chǎn)熱。這兩種脂肪組織有相同的分化特征，都是由間充質(zhì)干細胞分化而來。
體外誘導(dǎo)成脂分化的鑒定
1.檢測成脂誘導(dǎo)后細胞的胞漿中的油滴（脂肪滴）。脂肪滴經(jīng)油紅O染色后在顯微鏡下呈現(xiàn)顯著的紅色，未分化細胞則無明顯顏色。通過統(tǒng)計各樣品中成脂分化細胞的百分比來對成脂分化強弱加以表征對比。
2.MSC成脂分化后有明顯的成脂特征性基因表達，如LPL、PPARγ等�？墒褂肦T-PCR通過對相關(guān)基因表達量的測量，對比不同實驗組別的成脂分化差異。
OriCell®人脂肪間充質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化油紅O染色效果
OriCell®小鼠脂肪間充質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化油紅O染色效果
OriCell®小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化油紅O染色效果
實操走起
01 所需材料
1. OriCell® 間充質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化試劑盒（套裝內(nèi)A、B液成分含基礎(chǔ)培養(yǎng)基、優(yōu)級胎牛血清、成脂誘導(dǎo)添加物；油紅O染色液、明膠）
2. OriCell® Phosphate-Buffered Saline (1×PBS)（貨號：PBS-10001）
02 誘導(dǎo)分化操作步驟
（注：A、B液配置方法詳見產(chǎn)品說明書）
1.加1mL 0.1%明膠到六孔板中，搖勻，使其能均勻覆蓋各孔底面。
2. 將鋪有0.1%明膠的六孔板放置在超凈臺或CO2培養(yǎng)箱至少30min。
3. 30min后吸去明膠即可用于接種細胞，或等待六孔板晾干再接種。
4. 將待誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細胞按照 2×104cells/cm2的細胞密度接種于六孔板中，每孔加入2mL普通完全培養(yǎng)基。
5. 細胞置于37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6. 當細胞匯合度達到100%時，小心地將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向六孔板中加入2mL OriCell® 間充質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液。
7. 誘導(dǎo)3天后，吸去六孔板中的A液，加入2mL OriCell® 間充質(zhì)干細胞成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B液。
8. 維持1天后，吸去B液，換回A液進行誘導(dǎo)。
9. A液和B液交替使用，期間需每天觀察細胞狀態(tài)。若在A液誘導(dǎo)過程中出現(xiàn)細胞收縮、死亡的情況，請及時更換為B液，直至細胞狀態(tài)恢復(fù)。
10.重復(fù)誘導(dǎo)和維持過程，直到出現(xiàn)足量、大小適宜的脂滴，即可準備染色。
03 油紅O染色
1.成脂誘導(dǎo)分化結(jié)束后，吸去六孔板中的成脂誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基，用1×PBS輕柔洗滌2~3次。
2. 每孔加入2mL 4%多聚甲醛溶液（或 10%福爾馬林），室溫，固定30min。
3. 按油紅O貯存液：蒸餾水=3：2，配制為工作液�；靹蚝�250×g離心4min，使用上清。
4. 吸去固定液，用1×PBS輕柔洗滌2~3次，確保將固定液清洗徹底。
5. 每孔加入2 mL油紅O染料工作液，室溫染色 30 min。
6. 吸去油紅O染色液，用1×PBS輕柔洗滌2~3 次，充分洗去染色液。
7. 每孔加入2 mL 1×PBS，將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察成脂染色效果。
8. 染色后的六孔板用封口膜封裝后，置于4℃保存，但不要超過1周。脂滴會相互融合，無法保持染色時的狀態(tài)。
注意事項
1、本操作規(guī)程以六孔板為例，請根據(jù)實際情況選用合適的培養(yǎng)容器；
2、為減少誘導(dǎo)過程細胞漂起、不貼壁，建議使用明膠包被培養(yǎng)容器；
3、誘導(dǎo)培養(yǎng)基在使用前均需預(yù)熱至 37℃；
4、A液刺激脂滴形成；B液維持已形成的脂滴，并促進脂滴增大；
5、通常情況下，按照“A液3天，B液1天”的使用方式即可順利誘導(dǎo)細胞成脂；
6、各類、各批次細胞在誘導(dǎo)過程中可能出現(xiàn)多種情況，請靈活調(diào)整A、B液的使用比例；
7、為防止脂滴脫落，所有操作盡可能輕緩。
依賴于成熟的干細胞技術(shù)平臺，我們可以為您開展多種干細胞分化潛能研究的實驗服務(wù)。其中針對特定種屬優(yōu)化定制的誘導(dǎo)分化試劑盒，可向成骨、成脂、成軟骨、成肝等多個方向誘導(dǎo)，性能穩(wěn)定，誘導(dǎo)分化效果好！同時，我們可以按照您提供的誘導(dǎo)試劑和誘導(dǎo)方法為您完成特定的干細胞誘導(dǎo)實驗，也可以按照您的目的和要求，在各種干細胞誘導(dǎo)途徑中為您探索出一套相對完善的方法。
