用慢凍速融法保存細胞的原理

一般來講，細胞轉移最有效的方法是進行低溫保存（- 70℃～- 196℃），而細胞超低溫保存的基本原理是：當細胞處于- 70℃ 以下環(huán)境時，細胞內的酶活性均已停止，即代謝處于完全停止狀態(tài)，故而可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過 0～- 20℃ 階段的程序降溫，在此溫度范圍內，冰晶呈針狀，極易招致細胞的嚴重損傷。

經(jīng)過研究人員的長期試驗，發(fā)現(xiàn)細胞的凍存及復蘇基本原則是慢凍速融，這樣可以最大限度的保存細胞活力。
 

材料準備

1、儀器：凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、- 20℃、- 70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。

2、玻璃器皿：吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250 ml、100 ml）、廢液缸。

3、塑料器皿：吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10 ml）、15 ml 離心管、凍存管（1～2 ml）。

4、其他物品：微量加樣槍、紅血球計數(shù)板、記號筆、醫(yī)用橡皮膏、移液槍。

5、PBS, 胎牛血清，DMSO，培養(yǎng)液，雙抗，胰蛋白酶（0.25%）。
 

細胞凍存

目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由冰晶形成的細胞損傷。

1、10% 的 DMSO+ 90% 胎牛血清。甘油一般用于菌種保存很少用于細胞凍存。

2、取對數(shù)生長期的細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，懸浮生長的細胞則直接將細胞移至 15 ml 離心管中。

3、離心 1000 rpm,5 min。

4、去除胰蛋白酶及舊的培養(yǎng)液，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數(shù)，調節(jié)凍存液中細胞的最終密度為 5x10^6 /ml～1x10^7 /ml。

5、 在凍存管上標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。

6、凍存：標準的凍存程序為降溫速率- 1～- 2℃/min；當溫度達到- 25℃ 以下時，可增至- 5℃～- 10℃/min；到- 100℃ 時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入- 20℃ 冰箱 2 h，然后放入- 70℃ 冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內。

細胞復蘇

1、從液氮容器中取出凍存管，直接浸入 37℃ 溫水中，并不時搖動令其盡快融化。

2、從 37℃ 水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加 10 倍以上培養(yǎng)液，混勻。

3、離心，1000 rpm，5 min。

4、棄去上層清液，加入含 10% 胎牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調整細胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃ 培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

5、次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
 

注意要點

1、冷凍越慢越好，復蘇越快越好。

2、與液氮接觸的操作，注意戴保護眼鏡和手套。細胞復蘇時，水浴中搖動小瓶易爆炸。且 DMSO 為有毒致癌品，接觸時帶好手套。

3、凍存細胞數(shù)量要足夠，一般最低要達到 5x10^6 /ml。濃度視情況而定。

4、做好標記：培養(yǎng)瓶上應該用馬克筆做好標記，寫上細胞名稱、代數(shù)和凍存時間。

5、對剛復蘇的細胞動作要輕柔，避免細胞破裂。

6、DMSO 對大多數(shù)細胞不敏感，所以解凍之后不需要除去 DMSO，解凍后頻繁換液會慢慢除去 DMSO。部分對 DMSO 敏感的細胞需要除去 DMSO。

7、解凍后的細胞要用和以前一樣的培養(yǎng)液和血清，突然換不一樣的培養(yǎng)液和血清會造成細胞生長不良，甚至死亡。