乙醇酸氧化酶（glycollic oxidase, GO）試劑盒使用說明書

乙醇酸氧化酶（glycollic oxidase, GO）試劑盒說明書
分光光度法50管/48樣
 
注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
乙醇酸氧化酶（EC1.1.3.15）是植物光呼吸代謝中的關鍵酶，也是光下合成草酸的關鍵酶，它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，對研究光呼吸代謝過程及其調控具有重要意義。

測定原理：
乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸和鹽酸苯肼反應生成乙醛酸苯腙，在324nm有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器：
天平、低溫離心機、紫外分光光度計、1mL石英比色皿。

試劑組成和配制：
提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體35mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃避光保存，臨用前加10mL雙蒸水溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融。
試劑三：液體5mL×1瓶，4℃保存。

酶液提�。�
按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。12000g， 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
測定操作表：
 

	測定管
樣本（μL）	50
試劑一（μL）	650
試劑二（μL）	200
試劑三（μL）	100
充分混勻，立即于1mL石英比色皿中測定324nm處10s和190s吸光值A1和A2，△A=A2- A1

酶活性計算公式：
1．按照蛋白濃度計算
酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。
GO活性（nmol/min /mg prot）= ×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 392×△A÷Cpr
 
2．按照樣本質量計算
酶活性定義：每克組織每分鐘氧化1 nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。
GO活性（nmol/min /g 鮮重）= ×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T= 392×△A÷W
ε：乙醛酸苯腙毫摩爾消光系數(shù)：17L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應總體積，1mL；V樣：反應中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質量，g；T：反應時間，3min
 
注意事項：

• 測定之前進行預實驗，若吸光值較高，請將樣品用提取液進行適當?shù)南♂屧贉y定，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
• 色素含量較高的樣品，可在提取酶時加活性炭吸附。