快速、高通量的病毒中和抗體的檢測方法
簡介
新冠病毒的出現(xiàn)導(dǎo)致了世界范圍內(nèi)的新冠大流行，為了理解病毒的發(fā)病機(jī)理并開發(fā)疫苗，亟需快速開發(fā)多種研究工具。檢測病毒感染和疫苗接種后的免疫反應(yīng)對(duì)新冠病毒的研究十分重要。由于中和抗體是免疫反應(yīng)和疫苗效價(jià)的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，患者血清樣本中的中和性抗體水平是用于監(jiān)測有效性的重要參數(shù)。
人體血清中和抗體的鑒定常使用傳統(tǒng)方法例如蝕斑減少中和試驗(yàn) (PRNT) 來檢測。然而，該方法使用活的、具備感染性的病毒加入到靶細(xì)胞中，所以需要生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室以及耗時(shí)費(fèi)力的細(xì)胞培養(yǎng)。數(shù)據(jù)結(jié)果的分析耗費(fèi)時(shí)間并且不能自動(dòng)化。此外，假病毒中和試驗(yàn) (pVNT) 方法使用改良型的病毒，可以在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成，但此方法需要細(xì)胞培養(yǎng)和熒光成像來測得中和抗體活性，因此，也不適用于樣品的高通量篩選。
此 GeneScript cPass 新冠病毒中和抗體檢測試劑盒采用免病毒中和測試法 (sVNT) 來克服傳統(tǒng)的病毒中和實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)。它采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 的模式，如圖 1 和圖 2 所示。
優(yōu)點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)
•快速、簡單的 ELISA 實(shí)驗(yàn)流程設(shè)置
•無需三級(jí)實(shí)驗(yàn)室或細(xì)胞培養(yǎng)
•實(shí)驗(yàn)結(jié)果與蝕斑減少中和試驗(yàn)數(shù)據(jù)一致
刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)域的 HRP 偶聯(lián)片段與含有中和性抗體的患者血清樣本相結(jié)合。此混合物加入到已被 ACE2 受體包被的 ELISA 孔板中。如果樣品中的抗體有中和抗體的活性，那么 HRP-RBD 同 ACE2 的 結(jié)合將會(huì)被打破，隨后清洗，移除HRP-RBD。使用光吸收微孔板讀板機(jī)測量產(chǎn)生的信號(hào)，在中和抗體存在的情況下，此信號(hào)會(huì)更低，將此信號(hào)與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的信號(hào)進(jìn)行比較，可以評(píng)估待測樣本中存在的中和抗體活性。
在此替代的病毒中和實(shí)驗(yàn) (sVNT) 試 劑盒的數(shù)據(jù)結(jié)果，由SpectraMax 微孔 板讀 板機(jī) 進(jìn) 行檢 測、SoftMax Pro 軟件進(jìn)行分析得到。這些結(jié)果與先前使用的傳統(tǒng)假病毒中和試驗(yàn)(pVNT) 方法得到的結(jié)果密切相關(guān)，然而只需要一小部分地時(shí)間和更低的生物實(shí)驗(yàn)室安全等級(jí)限制。
圖 1 對(duì)比 PRNT 和 sVNT 試劑盒的操作流程。sVNT 實(shí)驗(yàn)方法能在二級(jí)實(shí)驗(yàn)室中 1 小時(shí)內(nèi)完成，而 PRNT 需要活的新冠病毒以及繁瑣的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在三級(jí)實(shí)驗(yàn)室中也要兩天多的時(shí)間。
圖 2 新冠病毒 sVNT 檢測方法。此實(shí)驗(yàn)使用 ELISA 模式，在待測樣本中通過中和性的抗體能夠檢測 RBD 與 ACE2 結(jié)合的擾動(dòng)。
材料
• GenScript cPass 新冠病毒中和抗體檢測試劑盒 (GenScript cat. #L00847-A)，
• 10 份血清樣本，已經(jīng)通過 PRNT (Corgenix) 方法證實(shí)中和抗 體陽性，
• 3 份血清樣本，已經(jīng)通過 PRNT (Corgenix) 方法證實(shí)中和抗體陰性，
• MultiWash+ 微孔板洗板機(jī) (Molecular Devices)
• 光吸收檢測模式用到的 Molecular Devices 酶標(biāo)儀：
• SpectraMax ABS Plus 酶標(biāo)儀
• SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀
• SpectraMax i3x 多功能酶標(biāo)儀
• SpectraMax M5e 多功能酶標(biāo)儀
在實(shí)驗(yàn)開始前，試劑盒的所有組分和待測樣本可放置于室溫。試劑盒中的試劑需要按如下操作稀釋：
• 用去離子水稀釋 20x 儲(chǔ)液得到 1x wash，
• 用 HRP 稀釋緩沖液按 1:1000 比例稀釋 HRP-RBD 儲(chǔ)液得到HRP-RBD 工作液。
待測樣本 和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組分別與 HRP 偶聯(lián)的 RBD 混合，并按如下操作孵育。待測樣本、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照，分別用樣品稀釋緩沖液按 1:10 比例稀釋，例如：12uL 待測樣品 + 108uL緩沖液。將稀釋后的樣品和對(duì)照組分別與等量的 HRP-RBD 工作液混合在不同的試管中，例如：120uL HRP-RBD 工作液 +
待測樣本 和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組分別與 HRP 偶聯(lián)的 RBD 混合，并按如下操作孵育。待測樣本、陽性對(duì)照、陰性對(duì)照，分別用樣品稀釋緩沖液按 1:10 比例稀釋，例如：12uL 待測樣品 + 108uL緩沖液。將稀釋后的樣品和對(duì)照組分別與等量的 HRP-RBD 工作液混合在不同的試管中，例如：120uL HRP-RBD 工作液 +
120uL 稀釋后的待測樣品或?qū)φ掌贰４嘶旌衔镌?37 度孵育15 分鐘。
分別添加 100uL 的陽性對(duì)照混合物、陰性對(duì)照混合物、待測樣品混合物至實(shí)驗(yàn)復(fù)孔中。然后封蓋，在 37 度孵育 15 分鐘。
使 用 MultiWash+ 洗 板機(jī) 和 1x wash 溶 液 清 洗 所有 的 微 孔板，每次每孔 300 uL，橫向吸液。然后，100uL TMB 溶液加入到每個(gè)孔中，封蓋，避光，室溫孵育 15 分鐘。
與 TMB 底物孵育后，50 uL 終止溶液加入到每個(gè)孔中，立即在多款酶標(biāo)儀上測讀，光吸收波長設(shè)置為 450 nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性評(píng)估看陰性對(duì)照的 OD450 值是否大于 1.0，陽性對(duì)照的值是否小于 0.3。如果不符合這些標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效，需要重復(fù)試驗(yàn)。各個(gè)待測樣本的百分比抑制值按如下公式計(jì)算：
表 1 的卡值被用來說明樣本的結(jié)果是陽性還是陰性，是否存在可檢測到的新冠中和抗體。表中的卡值來源于新冠 sVNT試劑盒手冊。對(duì)于不同地區(qū)和種族背景，使用者可以直接基于具有代表性的患者血清樣本設(shè)置卡
表 1 抑制性卡值大小用于說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
結(jié)果
使用陽性和陰性對(duì)照評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量。如表 2 所示，陰性對(duì)照的 OD450 值大于 1.0，陽性對(duì)照的 OD450 值小于 0.3，這是根據(jù) sVNT 試劑盒的質(zhì)量控制要求而定。
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表 2，陰性對(duì)照的 OD450 值大于 1.0，陽性對(duì)照的 OD450 值小于 0.3，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)照組做一次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，變異系數(shù) CV 值小于 30% 是可重現(xiàn)的。
如方法中所描述，待測樣本和陰性對(duì)照的 OD450 值用于計(jì)算百分比抑制值�；谠噭┖惺謨灾幸话愕目ㄖ堤攸c(diǎn)，百分比抑制值大于等于 30% 說明檢測到新冠中和抗體，呈陽性；百分比抑制值小于 30% 說明未檢測到新冠中和抗體，呈陰性。在PRNT 中和活性檢測中呈陰性的三個(gè)樣品，在 sVNT 檢測中也呈陰性。同樣地，在 PRNT 中和活性檢測中呈陽性的十個(gè)樣品，在 sVNT 檢測中也呈陽性 ( 如表 3)。
結(jié)論
表 3 先前測得的多個(gè)樣品的百分比抑制值和陽性、陰性結(jié)果。使用SpectraMax ABS Plus 獲得表中所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其他類型的酶標(biāo)儀也獲得相同的結(jié)果。
結(jié)論
此 GenScript cPass 新冠病毒中和抗體檢測試劑盒數(shù)據(jù)來源于一組患者血清樣本，與傳統(tǒng)的、耗時(shí)費(fèi)力的 PRNT 方法獲得的數(shù)據(jù)吻合。此 sVNT 試劑盒提供了易于使用的試劑和緊湊的 ELISA 工作流程，大約 1 小時(shí)能夠完成。其中必需的一步清洗操作由MultiWash+ 洗板機(jī)完成，節(jié)約了寶貴的時(shí)間。SpectraMax 讀板機(jī)和 SoftMax Pro 軟件產(chǎn)生的數(shù)據(jù)能夠運(yùn)用實(shí)驗(yàn)特異的方案進(jìn)行分析，設(shè)置公式可以應(yīng)用于所需的計(jì)算和自動(dòng)結(jié)果輸出。
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參考文獻(xiàn)
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