糖原磷酸化酶a（Glycogen phosphorylase a，GPa）試劑盒使用說明書

 
注    意：正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義：
糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代謝的關(guān)鍵酶，使糖原分子從非還原端逐個斷開α-1，4-糖苷鍵移去葡萄糖基，釋放1-磷酸葡萄糖，直至臨近糖原分子α-1，6-糖苷鍵分支點前4個葡萄糖基處。GP分為有活性的糖原磷酸化酶a（GPa）和無活性的糖原磷酸化酶b（GPb）兩種形式。糖原的分解主要在GPa的催化下進行。
 
測定原理：
未添加激活劑時，GPa催化糖原和無機磷產(chǎn)生葡萄糖殘基生成糖原和1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步依次催化NADP還原生成NADPH，在340nm下測定NADPH上升速率，即可反映GPa活性。
 
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
 
試劑的組成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；
試劑一：液體40 mL×1瓶， 4℃保存；
試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存；
試劑三：粉劑×1支，-20℃保存；
試劑四：粉劑×1支， -20℃保存；
 
樣本的前處理： 
按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
 
測定步驟：

• 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零；
• 工作液的配制：臨用前將試劑二轉(zhuǎn)移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
• 試劑三的配制：臨用前在試劑三瓶中加入2.5mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
• 試劑四的配制：臨用前在試劑四瓶中加入2.5mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
• 將工作液、試劑三和試劑四置于37℃預(yù)熱5分鐘；
• 在1mL石英比色皿中加入50μL樣本、50μL試劑三、50μL試劑四、50μL蒸餾水和800μL工作液，立

 
   即混勻，記錄340nm處5min后的A1和10min后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A2-A1。
 
GPa活性計算：
（1）按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
GPa（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
單位定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。
GPa（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=643×ΔA÷W
V反總：反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.05 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g。