鼠源脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)分享
脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells, ADSCs）是來(lái)源于脂肪組織的干細(xì)胞，與其它成體干細(xì)胞一樣具有自我更新和多向分化的能力。人和鼠的脂肪組織均可用于分離ADSCs，其中鼠脂肪組織通常取自腹股溝處脂肪墊。聽(tīng)說(shuō)你們都想偷師ADSCs原代取材，那就來(lái)安排！
⭐ 材料準(zhǔn)備
✔ OriCell®大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：RAXMD-90011）
✔ OriCell®胰蛋白酶細(xì)胞消化液（0.25%）（貨號(hào)：TEDTA-10001）
✔ 0.1% I型膠原酶溶液
⭐ 實(shí)驗(yàn)步驟
1、10天齡到4周齡大鼠1只，麻醉處死，75%乙醇浸泡消毒3~5min。無(wú)菌條件下切開(kāi)腹股溝皮膚，暴露腹股溝脂肪墊。
2、鈍性剝離脂肪組織，清洗并去除筋膜組織及小血管。將脂肪墊剪碎，轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。
3、加入3~4倍體積的0.1% I型膠原酶溶液，37℃水浴振蕩約20min，直至細(xì)胞混合物成乳狀濃稠液體。期間可吹打脂肪組織，輔助消化。
4、250×g，4℃，離心5min。注意離心機(jī)預(yù)冷至4℃。
5、小心吸去上層油脂，注意不要破壞位于下方的膠狀沉淀。加人5mL完全培養(yǎng)基,重懸沉淀，轉(zhuǎn)移到新的離心管中，再次離心5min。
6、重復(fù)洗滌一次，吸去上清。
7、加入8mL完全培養(yǎng)基重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃,5% CO2溫箱中。
8、待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)48h后首次觀察、換液。
9、換液時(shí)通過(guò)棄去培養(yǎng)基，從而去除未貼壁的細(xì)胞。
10、以后每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合達(dá)80%-90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，按1:2或1:3比例首次傳代。
⭐ 注意事項(xiàng)
✔ 取材時(shí)應(yīng)將組織清洗干凈，仔細(xì)剝離去除血管和筋膜組織
✔ 脂肪組織在剪碎的過(guò)程中不能研磨，以免破壞細(xì)胞
✔ 消化完后的組織在離心前把離心機(jī)預(yù)冷，使細(xì)胞更好的與油脂分離
✔ 用明膠或者膠原蛋白處理培養(yǎng)皿底壁，有利于細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)
⭐ 鑒定
1、形態(tài)學(xué)觀察：原代培養(yǎng)后，傳代2-3次，ADSCs呈現(xiàn)單層，梭狀或多枝狀的細(xì)胞形態(tài)，其直徑在25-30 um，待細(xì)胞達(dá)到匯合時(shí)，它們形態(tài)上呈紡錘形，類似于成纖維細(xì)胞，貼壁較牢固。
⭐ 材料準(zhǔn)備
✔ OriCell®大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基（貨號(hào)：RAXMD-90011）
✔ OriCell®胰蛋白酶細(xì)胞消化液（0.25%）（貨號(hào)：TEDTA-10001）
✔ 0.1% I型膠原酶溶液
⭐ 實(shí)驗(yàn)步驟
1、10天齡到4周齡大鼠1只，麻醉處死，75%乙醇浸泡消毒3~5min。無(wú)菌條件下切開(kāi)腹股溝皮膚，暴露腹股溝脂肪墊。
2、鈍性剝離脂肪組織，清洗并去除筋膜組織及小血管。將脂肪墊剪碎，轉(zhuǎn)移至15mL離心管中。
3、加入3~4倍體積的0.1% I型膠原酶溶液，37℃水浴振蕩約20min，直至細(xì)胞混合物成乳狀濃稠液體。期間可吹打脂肪組織，輔助消化。
4、250×g，4℃，離心5min。注意離心機(jī)預(yù)冷至4℃。
5、小心吸去上層油脂，注意不要破壞位于下方的膠狀沉淀。加人5mL完全培養(yǎng)基,重懸沉淀，轉(zhuǎn)移到新的離心管中，再次離心5min。
6、重復(fù)洗滌一次，吸去上清。
7、加入8mL完全培養(yǎng)基重懸沉淀，轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃,5% CO2溫箱中。
8、待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)48h后首次觀察、換液。
9、換液時(shí)通過(guò)棄去培養(yǎng)基，從而去除未貼壁的細(xì)胞。
10、以后每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基，細(xì)胞匯合達(dá)80%-90%時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，按1:2或1:3比例首次傳代。
⭐ 注意事項(xiàng)
✔ 取材時(shí)應(yīng)將組織清洗干凈，仔細(xì)剝離去除血管和筋膜組織
✔ 脂肪組織在剪碎的過(guò)程中不能研磨，以免破壞細(xì)胞
✔ 消化完后的組織在離心前把離心機(jī)預(yù)冷，使細(xì)胞更好的與油脂分離
✔ 用明膠或者膠原蛋白處理培養(yǎng)皿底壁，有利于細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)
⭐ 鑒定
1、形態(tài)學(xué)觀察：原代培養(yǎng)后，傳代2-3次，ADSCs呈現(xiàn)單層，梭狀或多枝狀的細(xì)胞形態(tài)，其直徑在25-30 um，待細(xì)胞達(dá)到匯合時(shí)，它們形態(tài)上呈紡錘形，類似于成纖維細(xì)胞，貼壁較牢固。
2、微生物：常使用培養(yǎng)法和PCR法檢測(cè)細(xì)菌、真菌、支原體。
3、增殖：CCK8生長(zhǎng)曲線，計(jì)算倍增時(shí)間。
4、標(biāo)記物檢測(cè)：一般的標(biāo)準(zhǔn)為CD29、CD44、CD73、CD105為陽(yáng)性（>70%）；CD34、CD45、CD11b為陰性（<5%）。
5、誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)：在特定的誘導(dǎo)條件下，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞。
3、增殖：CCK8生長(zhǎng)曲線，計(jì)算倍增時(shí)間。
4、標(biāo)記物檢測(cè)：一般的標(biāo)準(zhǔn)為CD29、CD44、CD73、CD105為陽(yáng)性（>70%）；CD34、CD45、CD11b為陰性（<5%）。
5、誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)：在特定的誘導(dǎo)條件下，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞。
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