基因與細胞治療領域的病毒載體生產用細胞株的開發(fā)
基因治療被認為是許多嚴重的和危及生命的疾病最有效和唯一的治療手段，得到越來越多人的關注。同時，基因治療的適應癥正從罕見/極罕見疾病向更常見疾病發(fā)生轉變，患者數(shù)量和綜合療法越來越多。因而，大規(guī)模的基因治療病毒載體生產是行業(yè)的迫切需求。
2020年，F(xiàn)DA更新了關于基因治療臨床試驗申請(INDs)的化學、制造和控制指導原則，內容包含穩(wěn)轉細胞株開發(fā)及細胞克隆性確證等。文件指出，細胞庫（Cell bank）的穩(wěn)定性及純度是一個需要考慮的重要方面（https://www.fda.gov）。非單克隆來源的細胞群中，其細胞異質性相對較高，產量低的細胞系往往與高產細胞群體競爭，導致高產細胞個體占比越來越少，最終隨著傳代次數(shù)的增加，導致細胞庫或工作庫的質量下降，因此，通過單克隆細胞篩選是提高病毒載體產量及質量的重要步驟。單克隆源性的確證是一種控制細胞種群降低其異質性的方法，通過防止異種細胞群體的產生，來保障未來生產出的病毒產品的質量不受影響。
CEVEC公司（CEVEC Pharmaceuticals）針對 ELEVECTA® AAV包裝細胞系的研究數(shù)據(jù)顯示，通過單克隆篩選出的細胞株其AAV產量要比非單克隆細胞來源的高10倍左右（https://cevec.com）。
張瑰宜博士在“生物藥生產用細胞株構建和篩選策略”研討會上分享了她們使用Cytena 的單細胞打印機SCP的感受，其以專利的噴墨式打印技術溫和而高效的分選單細胞，簡化篩選工作流程，極大的提高了單克隆有效率，獲得了穩(wěn)定性高及一致性好的單克隆，用于后續(xù)的AAV生產，大大的提高了AAV產量。
克隆HEK293細胞的記錄
HEK293單克隆細胞提高AAV產量
英國著名的葛蘭素史克（GlaxoSmithKline，GSK）藥物研究中心報告了一種如何快速獲得穩(wěn)轉的293T細胞，生成慢病毒載體的方法：將編碼所有慢病毒載體成分的單個 DNA 結構體穩(wěn)轉入293T細胞，單細胞打印機進行單克隆篩選，獲取遺傳學和功能穩(wěn)定的適應懸浮培養(yǎng)的生產用293細胞系。由此產生的懸浮細胞系可生產出與瞬時轉染一樣高滴度的病毒，可以在一次性攪拌罐生物反應器中輕松放大，并且在后續(xù)細胞培養(yǎng)中遺傳和功能穩(wěn)定。此方法將降低慢病毒載體的大規(guī)模生產成本，提升慢病毒載體在細胞治療中的應用價值。（Chen Y H , Pallant C , Sampson C J , et al. Rapid lentiviral vector producer cell line generation using a single DNA construct[J]. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2020.）
在基因編輯領域，Stephan Riesenberg等學者進行細胞克隆基因型和靶基因拷貝數(shù)分析時使用 Cas9 核糖核蛋白和 DNA 供體電穿孔在 FRMD7 基因中編輯 409-B2 hiPSC，分別用（不用）2 M M3814 處理細胞 3 天后使用單細胞打印機(Cytena)對細胞進行單克隆化用于后續(xù)分析。文章中HEK293 和 K562 細胞的單克隆化也是通過使用單細胞打印機分選單細胞來獲得的。（Stephan R , Manjusha C , Dominik M , et al. Simultaneous precise editing of multiple genes in human cells[J]. Nuclc Acids Research, 2019(19):19.）
Gross等采用f.sight™單細胞打印機，通過GFP報告基因，用于選擇和克隆CRISPR/Cas9編輯以敲除RANKL蛋白的間充質干細胞(MSC)，以進一步增強MSCs在再生醫(yī)學中的治療能力。
參考資料
[1] 提升高產細胞株篩選效率，助力基因治療、抗體藥物等工藝開發(fā)——單細胞打印機（附案例分享）
[2] 簡化CRISPR基因編輯的干細胞的工作流程，提高單克隆效率
2020年，F(xiàn)DA更新了關于基因治療臨床試驗申請(INDs)的化學、制造和控制指導原則，內容包含穩(wěn)轉細胞株開發(fā)及細胞克隆性確證等。文件指出，細胞庫（Cell bank）的穩(wěn)定性及純度是一個需要考慮的重要方面（https://www.fda.gov）。非單克隆來源的細胞群中，其細胞異質性相對較高，產量低的細胞系往往與高產細胞群體競爭，導致高產細胞個體占比越來越少，最終隨著傳代次數(shù)的增加，導致細胞庫或工作庫的質量下降，因此，通過單克隆細胞篩選是提高病毒載體產量及質量的重要步驟。單克隆源性的確證是一種控制細胞種群降低其異質性的方法，通過防止異種細胞群體的產生，來保障未來生產出的病毒產品的質量不受影響。
CEVEC公司（CEVEC Pharmaceuticals）針對 ELEVECTA® AAV包裝細胞系的研究數(shù)據(jù)顯示，通過單克隆篩選出的細胞株其AAV產量要比非單克隆細胞來源的高10倍左右（https://cevec.com）。
張瑰宜博士在“生物藥生產用細胞株構建和篩選策略”研討會上分享了她們使用Cytena 的單細胞打印機SCP的感受，其以專利的噴墨式打印技術溫和而高效的分選單細胞，簡化篩選工作流程，極大的提高了單克隆有效率，獲得了穩(wěn)定性高及一致性好的單克隆，用于后續(xù)的AAV生產，大大的提高了AAV產量。
克隆HEK293細胞的記錄
HEK293單克隆細胞提高AAV產量
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生物藥生產用細胞株構建和篩選策略
生物藥生產用細胞株構建和篩選策略
英國著名的葛蘭素史克（GlaxoSmithKline，GSK）藥物研究中心報告了一種如何快速獲得穩(wěn)轉的293T細胞，生成慢病毒載體的方法：將編碼所有慢病毒載體成分的單個 DNA 結構體穩(wěn)轉入293T細胞，單細胞打印機進行單克隆篩選，獲取遺傳學和功能穩(wěn)定的適應懸浮培養(yǎng)的生產用293細胞系。由此產生的懸浮細胞系可生產出與瞬時轉染一樣高滴度的病毒，可以在一次性攪拌罐生物反應器中輕松放大，并且在后續(xù)細胞培養(yǎng)中遺傳和功能穩(wěn)定。此方法將降低慢病毒載體的大規(guī)模生產成本，提升慢病毒載體在細胞治療中的應用價值。（Chen Y H , Pallant C , Sampson C J , et al. Rapid lentiviral vector producer cell line generation using a single DNA construct[J]. Molecular Therapy — Methods & Clinical Development, 2020.）
在基因編輯領域，Stephan Riesenberg等學者進行細胞克隆基因型和靶基因拷貝數(shù)分析時使用 Cas9 核糖核蛋白和 DNA 供體電穿孔在 FRMD7 基因中編輯 409-B2 hiPSC，分別用（不用）2 M M3814 處理細胞 3 天后使用單細胞打印機(Cytena)對細胞進行單克隆化用于后續(xù)分析。文章中HEK293 和 K562 細胞的單克隆化也是通過使用單細胞打印機分選單細胞來獲得的。（Stephan R , Manjusha C , Dominik M , et al. Simultaneous precise editing of multiple genes in human cells[J]. Nuclc Acids Research, 2019(19):19.）
Gross等采用f.sight™單細胞打印機，通過GFP報告基因，用于選擇和克隆CRISPR/Cas9編輯以敲除RANKL蛋白的間充質干細胞(MSC)，以進一步增強MSCs在再生醫(yī)學中的治療能力。
參考資料
[1] 提升高產細胞株篩選效率，助力基因治療、抗體藥物等工藝開發(fā)——單細胞打印機（附案例分享）
[2] 簡化CRISPR基因編輯的干細胞的工作流程，提高單克隆效率
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