CERO動(dòng)態(tài)3D培養(yǎng)在MSCs-GM促進(jìn)軟骨形成中的應(yīng)用

在軟骨組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，有許多臨床前研究表明干細(xì)胞能有效地使損傷軟骨組織恢復(fù)功能；另外，逾200例臨床試驗(yàn)采用干細(xì)胞來(lái)處理軟骨組織損傷，并研究其應(yīng)用于病患時(shí)的安全性、有效性、長(zhǎng)期可行性。其中，有些結(jié)果表明治療有效，有些則反之。

MSCs（間充質(zhì)干細(xì)胞）常被選為細(xì)胞材料。這是因?yàn)樗�具有多潛能性、安全性，且較少引發(fā)免疫反應(yīng)。有數(shù)據(jù)顯示，要在臨床中對(duì)患者有效治療，需要大量的MSCs（1千萬(wàn)-1億個(gè)細(xì)胞）。一些臨床研究采用單層2D細(xì)胞堆疊培養(yǎng)以獲取足量的細(xì)胞，這種方式需要較長(zhǎng)的體外培養(yǎng)周期。很多報(bào)告顯示長(zhǎng)期體外培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞喪失干性，包括有絲分裂能力、集落形成單位效率。另外，還有報(bào)告顯示MSCs隨著培養(yǎng)時(shí)間增加會(huì)傾向于失去分化為軟骨組織的潛能。這解釋了上述臨床試驗(yàn)失敗的可能原因。

該試驗(yàn)在GM（明膠微球）表面接種BMSCs（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）后，放入CERO中進(jìn)行3D培養(yǎng)，以期提高細(xì)胞產(chǎn)量；另外，采取了動(dòng)態(tài)培養(yǎng)的模式，以期通過機(jī)械刺激增加軟骨分化形成。

該試驗(yàn)使用CERO 3D懸浮培養(yǎng)儀，通過精確的旋轉(zhuǎn)參數(shù)設(shè)置，來(lái)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、周期性、間歇性的3D動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)。通過CERO的50ml培養(yǎng)管內(nèi)部的鰭片結(jié)構(gòu)，輕松的實(shí)現(xiàn)攪動(dòng)懸浮，并且極大程度的降低了剪切力，較少細(xì)胞損傷。

另外進(jìn)行了靜態(tài)3D培養(yǎng)，也在組織培養(yǎng)平板上進(jìn)行了培養(yǎng)，來(lái)進(jìn)行對(duì)比。下面介紹其實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果。

制備GM
采用油包水的方法制備GM，A為干條件下的圖像，B為濕條件下的圖像。D展示了GM的球狀形態(tài)和光滑表面。

接種和培養(yǎng)BMSCs

在CERO中通過精確的設(shè)置參數(shù)，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的間歇式攪拌，使用FD培養(yǎng)基將BMSCs接種到GM上，獲得BMSCs-GM。
 

D為第7天的BMSCs-GM的CLSM圖像，用Hoechst染色細(xì)胞核，鬼筆環(huán)肽-TRITC染色細(xì)胞肌動(dòng)蛋白。A、B、D比例尺均為100μm。

“2D”和“3D”培養(yǎng)的對(duì)比

A中可以看出隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，3D培養(yǎng)（BMSCs-GM）的細(xì)胞產(chǎn)量明顯高于2D培養(yǎng)（GMSCs-TCP，組織培養(yǎng)板）。

另外，C中可以看出3D、2D培養(yǎng)都可以分化出三種主要細(xì)胞譜系：骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞。比例尺為100μm。

動(dòng)態(tài)、靜態(tài)環(huán)境下的細(xì)胞和ECM

本圖顯示了不同培養(yǎng)基，動(dòng)態(tài)/靜態(tài)的差異。簡(jiǎn)寫中，前兩字母的CM代表CIM培養(yǎng)基（軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基），F(xiàn)D代表FD培養(yǎng)基（F12：DMEM=1：1）；末尾字母S代表靜態(tài)（static），D代表動(dòng)態(tài)（dynamic）。

CERO動(dòng)態(tài)3D培養(yǎng)條件下，細(xì)胞和ECM產(chǎn)量明顯高于靜態(tài)培養(yǎng)。并且，BMSCs在微球體表面積累了大量ECM蛋白，表明細(xì)胞-細(xì)胞間聯(lián)系、細(xì)胞-微球體間聯(lián)系均有產(chǎn)生。

E中比例尺100μm；F中比例尺40μm。

軟骨分化對(duì)比

免疫組織化學(xué)染色圖像顯示出了II型膠原蛋白的表達(dá)，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件高于靜態(tài)培養(yǎng)條件。蛋白多糖亦然。

結(jié)語(yǔ)
CERO的3D動(dòng)態(tài)懸浮培養(yǎng)明顯地提升了細(xì)胞、ECM產(chǎn)量，且有利于BMSCs的軟骨分化。

文獻(xiàn)：
Sulaiman, S.; Chowdhury, S.R.; Fauzi, M.B.; Rani, R.A.; Yahaya, N.H.M.; Tabata, Y.; Hiraoka, Y.; Binti Haji Idrus, R.; Min Hwei, N. 3D Culture of MSCs on a Gelatin Microsphere in a Dynamic Culture System Enhances Chondrogenesis. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 2688. https://doi.org/10.3390/ijms21082688