單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）試劑盒使用說明書

 
注   意 ：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
MDHAR催化MDHA還原生成AsA，在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。

測定原理：
MDHAR 催化 NADH 還原MDHA 生成 AsA和NAD⁺，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD⁺沒有。通過測定340 nm光吸收下降速率，來計算出MDHAR活性。

實驗中所需儀器及設(shè)備：
研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液槍和雙蒸水

試劑組成和配置：
試劑一：液體50mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體50mL×1瓶，室溫保存。
試劑三：粉劑×1瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解。
試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水充分溶解。
試劑五：液體25μL×1瓶，4℃保存。臨用前加5mL試劑二充分溶解。

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• 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。
• . 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；8000g ，4℃離心20min，取上清液置冰上混勻待測。

3.  血清等液體：直接測定。

MDHAR測定操作：
1. 分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。
3. 依次在比色皿中加入100μL試劑三、100μL試劑四、100μL試劑五和600μL試劑二，最后加入100μL上清液，迅速混勻后于340nm比色，記錄30s和150s的吸光值A(chǔ)1和A2，△A=A1-A2。

MDHAR活性計算公式：
(1). 按蛋白濃度計算
MDHAR活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。
 
MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（Cpr×V樣）÷T= 804×△A ÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
MDHAR活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH 為1U。
MDHAR (nmol/min /g鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（W×V樣÷V樣總）÷T= 804×△A ÷W
（3）按細胞數(shù)量計算
MDHAR活性單位定義：25℃中每10⁴個細胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。
MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（細胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T= 804×△A ÷ 細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
MDHAR活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化1nmol NADH 為1個酶活單位。
MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷V樣）÷T= 804×△A
ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，1mL=0.001 L，V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，100μL=0.1mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒；V樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，2min。

注意事項：
臨用前配制的試劑未使用完的4℃保存，3天內(nèi)使用完。