喻德躍教授團隊采用磷酸化組揭秘大豆開花和抗蟲之間的協(xié)調關系
光周期敏感的植物，如大豆，在整個生長期都面臨食葉性昆蟲的危害，而開花期經(jīng)常與害蟲高發(fā)期一致。目前，尚不清楚植物如何協(xié)調其開花和抗蟲性之間的關系。
2022年5月31日，國際頂尖植物期刊Plant Physiol（IF 8.34）在線發(fā)表了南京農業(yè)大學喻德躍教授團隊李霄等老師的創(chuàng)新研究成果“CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE38 regulates flowering time and common cutworm resistance in soybean”。該研究揭示了大豆GmCDPK38在調控開花時間和抗蟲性中的雙重功能及其在大豆馴化中的進化規(guī)律，為植物開花與抗蟲性的研究方向提供了新思路。其中中科新生命提供了磷酸化蛋白質組檢測服務。
研究材料
大豆Jack（WT植株）、gmcdpk38突變體和攜帶GmCDPK38 Hap2或Hap3單倍型的大豆材料
技術路線
步驟1：光周期調控GmCDPK38的表達；
步驟2：GmCDPK38的遺傳變異與大豆開花時間和對斜紋夜蛾（CCW）的抗性相關；
步驟3：CRISPR/Cas9介導的GmCDPK38 Hap3靶向突變導致大豆開花延遲，并增強對CCW的抗性；
步驟4：利用磷酸化蛋白質組篩選GmCDPK38的下游底物；
步驟5：RNA-seq分析揭示GmCDPK38影響的基因表達；
步驟6：gmcdpk38突變體中多種代謝產(chǎn)物的積累增加；
步驟7：GmCDPK38翻譯后調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸合酶；
步驟8：GmCDPK38是一個馴化基因，抗性的Hap2可能是一個人工選擇靶點。
研究結果
1. 光周期調控GmCDPK38的表達
GmCDPK38是鈣依賴性蛋白激酶第IV亞家族成員。通過光周期實驗發(fā)現(xiàn)GmCDPK38在長日照（LD）條件下的表達水平大于短日照（SD）。隨后通過分析GmCDPK38的日表達模式，發(fā)現(xiàn)在LD條件下，GmCDPK38的表達量在白天減少，夜間增加。在SD條件下觀察到該基因存在相同的表達模式，但其轉錄的幅度和豐度低于LD。這些結果表明，GmCDPK38的表達受光周期調節(jié)，在LD條件下表達量更高（圖1）。
圖1 GmCDPK38表達分析
2. GmCDPK38的遺傳變異與大豆開花時間和對斜紋夜蛾（CCW）的抗性相關
分析了272株栽培大豆中的GmCDPK38序列，在至少7種環(huán)境中，18個多態(tài)性位點與開花時間的變化顯著相關。其中，含單倍型2（Hap2）的大豆的開花時間明顯晚于含Hap3。此外，具有晚花Hap2的栽培大豆對CCW更具抗性。在LD和SD條件下，Hap2中的GmCDPK38表達顯著低于Hap3，其啟動子活性也低于Hap3。綜上，GmCDPK38可能在花期和抗蟲性方面發(fā)揮作用（圖2）。
圖2 大豆GmCDPK38單倍型分析
3. CRISPR/Cas9介導的GmCDPK38 Hap3靶向突變導致大豆開花延遲，并增強對CCW的抗性
大豆品種Jack中的GmCDPK38序列屬于Hap3。比較野生型（WT）Jack植株和gmcdpk38突變體的開花時間，發(fā)現(xiàn)突變體的開花時間晚于WT植株。此外，在LD條件下評估gmcdpk38突變體和WT植株的抗蟲性，實驗表明GmCDPK38的突變提高了大豆對CCW的抗性（圖3）。
圖3 T3 gmcdpk38突變體的表型鑒定
4. 利用磷酸化蛋白質組篩選GmCDPK38的下游底物
通過定量磷酸化蛋白質組學分析檢測WT植株和gmcdpk38突變體中的磷酸蛋白。數(shù)據(jù)顯示了一系列可能的GmCDPK38激酶下游底物，推斷GmCDPK38可能通過影響這些蛋白質的磷酸化來介導大豆開花和抗蟲性（圖4）。
圖4 磷酸蛋白質組數(shù)據(jù)總結
5. RNA-seq分析揭示GmCDPK38影響的基因表達
通過RNA-seq鑒定了大量與抗性和開花相關的表達基因。GmCDPK38突變誘導大多數(shù)開花抑制基因的表達，而gmcdpk38突變體中大多數(shù)開花促進基因表達下調。此后通過RT-qPCR證實這些基因表達與RNA-seq結果一致（圖5）。
圖5 GmCDPK38誘導T3 gmcdpk38突變體基因表達的變化
6. gmcdpk38突變體中多種代謝產(chǎn)物的積累增加
對WT和gmcdpk38突變體進行靶向代謝組學分析。在LD下42天，與WT相比，突變體中65.28%的代謝產(chǎn)物含量顯著增加，其中包含16個不同的化合物類別。大多數(shù)差異代謝產(chǎn)物，包括類黃酮、苯丙烷、多酚、酚酰胺、生物堿和萜類，都是已知的植物內源性防御代謝物。SD下29天的代謝物水平下降的比例（48.93%）高于LD下42天。綜上，GmCDPK38的突變誘導多種代謝物的積累，尤其是在LD條件下（圖6）。
圖6 T3 gmcdpk38突變體各類差異代謝產(chǎn)物數(shù)量
7. GmCDPK38翻譯后調節(jié)S-腺苷甲硫氨酸合酶
磷酸化蛋白質組學數(shù)據(jù)顯示S-腺苷甲硫氨酸合酶GmSAMS1僅在WT組中發(fā)生磷酸化。通過酵母雙雜交（Y2H）和雙分子熒光互補（BiFC）實驗，發(fā)現(xiàn)GmCDPK38與GmSAMS1互作并可能導致GmSAMS1磷酸化。進一步研究發(fā)現(xiàn)與防御相關的S-腺苷甲硫氨酸合酶在gmcdpk38突變體中在翻譯后上調表達，表明GmCDPK38突變增強了大豆對CCW的抗性（圖7）。
圖7 T3 gmcdpk38突變體S-腺苷甲硫氨酸合酶翻譯后上調
8. GmCDPK38是一個馴化基因，抗性的Hap2可能是一個人工選擇靶點
Hap2在栽培大豆中出現(xiàn)的頻率高于野生大豆，多出現(xiàn)在低緯度地區(qū)，而Hap3在野生大豆中出現(xiàn)的頻率更高，主要分布在高緯度地區(qū)。Hap2在主栽品種的高頻出現(xiàn)表明該等位基因可能是人工馴化的結果。通過計算馴化指標，發(fā)現(xiàn)GmCDPK38在大豆馴化中受到選擇（圖8）。
圖8 GmCDPK38在大豆馴化中受到選擇
小編小結
本研究利用基因編輯、磷酸化修飾組學、代謝組學等分析證實鈣依賴性蛋白激酶GmCDPK38在協(xié)調大豆開花時間調節(jié)和抗蟲性方面起著雙重作用。GmCDPK38在野生大豆中具有豐富的遺傳多樣性，可能是在大豆馴化過程中選擇的。
