利用生物反應器體外培養(yǎng)肺癌細胞的方法及效果驗證
癌細胞體外培養(yǎng)方法
生物反應器的低剪切應力動態(tài)培養(yǎng)測試完成后。
1. 選擇非小細胞肺癌 (NSCLC) 細胞系 Calu-3，并將動態(tài)培養(yǎng)的結果與靜態(tài)懸浮培養(yǎng)對照進行比較。具體而言，細胞在添加了 10% 胎牛血清 (FBS)、1% 青霉素/鏈霉素 (P/S) 和 1% 非必需品的完全培養(yǎng)基 (DMEM) 中生長氨基酸 (NEAA, Sigma )，并在 37°C 和 5% CO 2的水飽和氣氛中維持在標準細胞培養(yǎng)條件下在空氣中。
2. 在細胞培養(yǎng)瓶中擴增后，將 9x10 6 Calu-3 細胞 (1.92x10 5細胞/mL) 接種在生物反應器培養(yǎng)室內，并在具有完全生長培養(yǎng)基的動態(tài)懸浮液中培養(yǎng) 5 天。
3. 生物反應器以 5 mL/min 的流速運行。同時，Calu-3 細胞以相同的密度接種在用作對照的低附著培養(yǎng)瓶（Corning Inc）上，代表靜態(tài)懸浮培養(yǎng)模型。
4. 五天后，分別從生物反應器和低附著培養(yǎng)瓶中取出動態(tài)和靜態(tài)懸浮培養(yǎng)的細胞，并重新懸浮在新鮮的生長培養(yǎng)基中進行進一步分析。進行三個獨立的靜態(tài)和動態(tài)懸浮培養(yǎng)。
細胞體外培養(yǎng)的 驗證
通過倒置顯微鏡（Olympus ）研究從生物反應器和低附著培養(yǎng)瓶中收獲并重新懸浮在新鮮生長培養(yǎng)基中的 Calu-3 細胞。
通過細胞掃描儀和圖像分析軟件收集和分析顯微照片，以便 計算單個 Calu-3 細胞的數量和形成球體的 Calu-3 細胞的數量，以及確定球體尺寸。
細胞的TEM分析
對來自動態(tài)和靜態(tài)懸浮培養(yǎng)物的 Calu-3 細胞進行了處理，用于透射電子顯微鏡 (TEM) 分析和免疫細胞化學。
TEM 分析步驟如下：將 Calu-3 細胞固定在 Karnovsky 溶液（4% 甲醛、5% 戊二醛）中。樣品在 1% 四氧化鋨中后固定，并通過增加酒精濃度進行脫水。然后，用環(huán)氧丙烷洗滌樣品并嵌入環(huán)氧樹脂中。用亞甲藍和番紅對 0.5 μm 厚的切片進行染色，以從形態(tài)上選擇感興趣的區(qū)域。隨后，在 300 目銅網格上收集超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，在 TEM下進行定性檢查。
驗證活躍細胞周期中的細胞比例
用抗 Ki67）和抗 γ 組蛋白 H2AX抗體染色細胞斑點，并用 DAB（3,3'-二氨基聯苯胺）顯示過氧化物酶 (HRP) 底物試劑盒反應。Ki67 和 γH2AX 陽性細胞分數的定量驗證是通過計算每個分析樣品上計數的總共 900-2000 個細胞核中的陽性細胞核數來進行的。使用細胞凋亡試劑盒研究單細胞水平的凋亡細胞死亡。使用Olympus BX60或明美顯微鏡測量綠色核熒光陽性。4',6-二脒-2-苯炔醇 。通過計算總共近 1000 個細胞中的凋亡細胞核的數量來驗證死細胞的比例。使用單向方差分析測試分析數據。當 p<0.05 時，結果被認為具有統(tǒng)計學意義。
研究在生物反應器內動態(tài)培養(yǎng)
5天后細胞/球體可能意外粘附在過濾器上，過濾器用4%多聚甲醛固定，在室溫下與DAPI一起孵育15分鐘，依次用熒光顯微鏡觀察驗證其表面是否存在核。
驗證培養(yǎng)室下部是否存在粘附的 Calu-3 細胞和沉淀
細胞體外培養(yǎng)收獲時，用細胞刮刀刮擦培養(yǎng)室的內壁，并用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 洗滌。因此將PBS收集在培養(yǎng)皿中并通過倒置顯微鏡觀察以檢測Calu-3細胞的存在。
蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司十三年來專注于生物實驗室儀器設備B2B專業(yè)供應，主要產品包括生物反應器、發(fā)酵罐、細胞生物反應器、微生物發(fā)酵罐、搖床等細胞培養(yǎng)及制藥相關實驗室儀器。同時提供細胞培養(yǎng)瓶、滾瓶、培養(yǎng)板、移液器吸頭、離心管、PCR管等實驗室耗材。
生物反應器的低剪切應力動態(tài)培養(yǎng)測試完成后。
1. 選擇非小細胞肺癌 (NSCLC) 細胞系 Calu-3，并將動態(tài)培養(yǎng)的結果與靜態(tài)懸浮培養(yǎng)對照進行比較。具體而言，細胞在添加了 10% 胎牛血清 (FBS)、1% 青霉素/鏈霉素 (P/S) 和 1% 非必需品的完全培養(yǎng)基 (DMEM) 中生長氨基酸 (NEAA, Sigma )，并在 37°C 和 5% CO 2的水飽和氣氛中維持在標準細胞培養(yǎng)條件下在空氣中。
2. 在細胞培養(yǎng)瓶中擴增后，將 9x10 6 Calu-3 細胞 (1.92x10 5細胞/mL) 接種在生物反應器培養(yǎng)室內，并在具有完全生長培養(yǎng)基的動態(tài)懸浮液中培養(yǎng) 5 天。
3. 生物反應器以 5 mL/min 的流速運行。同時，Calu-3 細胞以相同的密度接種在用作對照的低附著培養(yǎng)瓶（Corning Inc）上，代表靜態(tài)懸浮培養(yǎng)模型。
4. 五天后，分別從生物反應器和低附著培養(yǎng)瓶中取出動態(tài)和靜態(tài)懸浮培養(yǎng)的細胞，并重新懸浮在新鮮的生長培養(yǎng)基中進行進一步分析。進行三個獨立的靜態(tài)和動態(tài)懸浮培養(yǎng)。
細胞體外培養(yǎng)的 驗證
通過倒置顯微鏡（Olympus ）研究從生物反應器和低附著培養(yǎng)瓶中收獲并重新懸浮在新鮮生長培養(yǎng)基中的 Calu-3 細胞。
通過細胞掃描儀和圖像分析軟件收集和分析顯微照片，以便 計算單個 Calu-3 細胞的數量和形成球體的 Calu-3 細胞的數量，以及確定球體尺寸。
細胞的TEM分析
對來自動態(tài)和靜態(tài)懸浮培養(yǎng)物的 Calu-3 細胞進行了處理，用于透射電子顯微鏡 (TEM) 分析和免疫細胞化學。
TEM 分析步驟如下：將 Calu-3 細胞固定在 Karnovsky 溶液（4% 甲醛、5% 戊二醛）中。樣品在 1% 四氧化鋨中后固定，并通過增加酒精濃度進行脫水。然后，用環(huán)氧丙烷洗滌樣品并嵌入環(huán)氧樹脂中。用亞甲藍和番紅對 0.5 μm 厚的切片進行染色，以從形態(tài)上選擇感興趣的區(qū)域。隨后，在 300 目銅網格上收集超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后，在 TEM下進行定性檢查。
驗證活躍細胞周期中的細胞比例
用抗 Ki67）和抗 γ 組蛋白 H2AX抗體染色細胞斑點，并用 DAB（3,3'-二氨基聯苯胺）顯示過氧化物酶 (HRP) 底物試劑盒反應。Ki67 和 γH2AX 陽性細胞分數的定量驗證是通過計算每個分析樣品上計數的總共 900-2000 個細胞核中的陽性細胞核數來進行的。使用細胞凋亡試劑盒研究單細胞水平的凋亡細胞死亡。使用Olympus BX60或明美顯微鏡測量綠色核熒光陽性。4',6-二脒-2-苯炔醇 。通過計算總共近 1000 個細胞中的凋亡細胞核的數量來驗證死細胞的比例。使用單向方差分析測試分析數據。當 p<0.05 時，結果被認為具有統(tǒng)計學意義。
研究在生物反應器內動態(tài)培養(yǎng)
5天后細胞/球體可能意外粘附在過濾器上，過濾器用4%多聚甲醛固定，在室溫下與DAPI一起孵育15分鐘，依次用熒光顯微鏡觀察驗證其表面是否存在核。
驗證培養(yǎng)室下部是否存在粘附的 Calu-3 細胞和沉淀
細胞體外培養(yǎng)收獲時，用細胞刮刀刮擦培養(yǎng)室的內壁，并用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 洗滌。因此將PBS收集在培養(yǎng)皿中并通過倒置顯微鏡觀察以檢測Calu-3細胞的存在。
蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司十三年來專注于生物實驗室儀器設備B2B專業(yè)供應，主要產品包括生物反應器、發(fā)酵罐、細胞生物反應器、微生物發(fā)酵罐、搖床等細胞培養(yǎng)及制藥相關實驗室儀器。同時提供細胞培養(yǎng)瓶、滾瓶、培養(yǎng)板、移液器吸頭、離心管、PCR管等實驗室耗材。
