傳代細胞的常規(guī)培養(yǎng)方法簡介

當原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞不斷分裂，一方面由于細胞密度過大，細胞與細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止將一方面也會因營養(yǎng)物枯竭和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。因此需要將培養(yǎng)細胞進行分離擴大培養(yǎng)，細胞由原培養(yǎng)瓶內分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的這個過程稱為傳代或者再培養(yǎng)。
 

傳代時間一般通過兩個方面進行確定：一是在細胞培養(yǎng)過程中，當培養(yǎng)液由于 ph值下降而呈現黃色時，表明細胞已經達到最大密度，需要換液或進行傳代培養(yǎng)；二是觀察細胞形態(tài)，健康細胞形態(tài)飽滿，折光性好，生長致密時即可傳代。初代培養(yǎng)的首次傳代很重要，是建立細胞系的關鍵時期。在首次傳代時一般要特別注意以下3點：
 

①細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面之前，不要急于傳代。

②原代培養(yǎng)時細胞多為混雜生長，上皮樣細胞和成纖維樣細胞并存的情況很常見。傳代時不同的細胞有不同的消化時間，因此要根據需要，注意觀察及時進行處理，并可根據不同細胞對胰蛋白酶的耐受時間不同而分離和純化所需要的細胞。另外早期傳代的培養(yǎng)細胞較已經建系的培養(yǎng)消化時間相對較長。吹打細胞時動作要輕巧，盡可能減少對細胞的損傷。

③首次傳代時細胞接種數量要多一些，使細胞能盡快適應新環(huán)境有利于細胞生存和增殖。隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。

02 生長周期和傳代比例
 

體外培養(yǎng)技術中所謂的傳“代”概念并不等于細胞生物學中“親代細胞”與“子代細胞”中“代”的概念。傳代培養(yǎng)的實質就是分離后再次培養(yǎng)，進行一次分離再培養(yǎng)稱之為傳一代，傳代數可以衡量培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡。
 

傳代是細胞分裂造成的結果，細胞從一次分裂結束到下一次分裂結束為一個細胞周期，分為間期與分裂期兩個階段。細胞周期能準確表示細胞增殖速度。兩次細胞分裂之間的時間也可以用細胞世代時間來表示，所以細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。正常細胞培養(yǎng)的世代數有限，只有癌細胞和發(fā)生轉化的細胞才能無限生長下去。

傳代代數與細胞的世代數（增殖代數）并不是同一個概念。在細胞培養(yǎng)時，所說的“第6代細胞”指細胞已經傳代6次。以貼壁細胞為例，每傳代一次，大概要倍增3~6次，細胞要經歷如下生長過程：游離期、貼壁期、潛伏期、對數生長期和停止期（平臺期）。當細胞達到平臺期時，就要進行傳代培養(yǎng)，否則細胞會中毒，發(fā)生形態(tài)改變，甚至死亡。

培養(yǎng)細胞有密度依賴和接觸抑制的特點，細胞濃度過低，不易存活，表現為細胞在達到增長前有較長的滯留期；細胞濃度過高，發(fā)生接觸抑制后生長遲緩甚至死亡，所以傳代比例通常按1:2~1:4的稀釋度進行。傳代后細胞的接種濃度一般為5x105個/mL。

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