FV3000共聚焦和微流控實現(xiàn)釀酒酵母單細(xì)胞復(fù)制壽命檢測
Make it EVIDENT
本期推出【FV3000 Makes Yeast Evident】
東南大學(xué)電子科學(xué)與工程學(xué)院 MEMS教育部重點實驗室
釀酒酵母與復(fù)制壽命檢測
細(xì)胞及生物體的衰老是一個復(fù)雜的生理過程，通常被認(rèn)為是由分子、細(xì)胞和器官的損傷不斷積累造成。
釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），又稱出芽酵母（Budding yeast），作為首個實現(xiàn)完整基因組測序的模式真核細(xì)胞，具有繁殖迅速、培養(yǎng)條件簡單、基因組小等優(yōu)點，并且與人類的衰老曲線相似，成為衰老壽命研究的理想模型。
釀酒酵母在死亡之前只能產(chǎn)生有限數(shù)量的子細(xì)胞，這種現(xiàn)象被稱為復(fù)制衰老，而在死亡前產(chǎn)生的子細(xì)胞的數(shù)量被稱為復(fù)制壽命（Replicative Lifespan, RLS）。
B 酵母細(xì)胞復(fù)制壽命示意圖[2]
酵母細(xì)胞復(fù)制壽命的傳統(tǒng)測量手段是基于1959年提出的微解剖法，即利用微解剖針手動剔除培養(yǎng)板上單個酵母細(xì)胞產(chǎn)生的每代子細(xì)胞，從而得到復(fù)制壽命。該方法具有效率低、周期長、樣本量小、對細(xì)胞易造成損傷等缺點。
而微流控芯片可利用微結(jié)構(gòu)實現(xiàn)酵母單細(xì)胞的捕獲，利用流體力剪切去除子細(xì)胞，為釀酒酵母自動化高通量單細(xì)胞培養(yǎng)和高時空分辨率監(jiān)測提供可能，但有如下局限：
-
現(xiàn)有微流控芯片在細(xì)胞捕獲穩(wěn)定性、子細(xì)胞剪切效率、復(fù)制壽命檢測精確性等方面都有待于提高；
- 現(xiàn)有微流控芯片較少關(guān)注大體積、隨機出芽的雙倍體酵母細(xì)胞的捕獲培養(yǎng)和壽命檢測。
顯微成像技術(shù)在課題研究中的作用
東南大學(xué)電子科學(xué)與工程學(xué)院MEMS教育部重點實驗室朱真副教授團隊利用高通量微流控芯片取得了釀酒酵母單細(xì)胞復(fù)制衰老壽命研究的重要進展，相關(guān)研究成果于3月31日以“A high throughput microfluidic diploid yeast long term culturing (DYLC) chip capable of bud reorientation and concerted daughter dissection for replicative lifespan determination”為題，發(fā)表在國際期刊Journal of Nanobiotechnology上（影響因子：10.435，doi：/10.1186/s12951-022-01379-9）。
該論文研制的高通量釀酒酵母單細(xì)胞捕獲-培養(yǎng)-解剖微流控芯片，與奧林巴斯FV3000激光掃描共聚焦顯微鏡雙劍合璧，成功實現(xiàn)對雙倍體釀酒酵母母細(xì)胞的可靠捕獲和子細(xì)胞的一致性剪切，進而實現(xiàn)穩(wěn)定的長期培養(yǎng)和完整的復(fù)制壽命檢測研究。
A 微流控芯片溝道實物圖B 微結(jié)構(gòu)陣列區(qū)實物圖
C母細(xì)胞在捕獲結(jié)構(gòu)中帶芽旋轉(zhuǎn)和子細(xì)胞剪切過程示意圖
針對不同“瓶身”長度，時序圖像顯示在母細(xì)胞較小時，捕獲結(jié)構(gòu)容易捕獲上游剪切下的細(xì)胞。而母細(xì)胞接近凋亡時，由于體積增大，子細(xì)胞旋轉(zhuǎn)至“瓶頸”的成功率降低，朝向“瓶身”上游生長的子細(xì)胞會將母細(xì)胞拖拽造成樣本丟失。根據(jù)統(tǒng)計的母細(xì)胞穩(wěn)定保持的比例，最終確定“瓶身”長度優(yōu)化值。
A 4小時內(nèi)微捕獲陣列中的空結(jié)構(gòu)實現(xiàn)“自填充”
B 4小時內(nèi)單細(xì)胞捕獲效率提升
C 較短“瓶身”的捕獲結(jié)構(gòu)，朝向上游的子細(xì)胞將母細(xì)胞拖拽造成樣本丟失
D 較長“瓶身”的捕獲結(jié)構(gòu)，易捕獲上游剪切下的細(xì)胞
接下來，研究人員在高通量單細(xì)胞長時間培養(yǎng)過程中，通過視頻拍攝觀測并驗證了母細(xì)胞在初始出芽時的動態(tài)旋轉(zhuǎn)，并在芽稍大時重新定向至“瓶頸”處，且停止旋轉(zhuǎn)直到胞質(zhì)分裂完成后被解剖分離。通過時序成像，驗證了母細(xì)胞在多代子細(xì)胞之間，面臨隨機的出芽位點依然能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的“瓶頸”定向和子細(xì)胞剪切。
視頻2：母細(xì)胞在細(xì)胞周期內(nèi)出芽旋轉(zhuǎn)至成熟子細(xì)胞剪切的動態(tài)過程
以10分鐘時間間隔的時序成像過程中，上一代子細(xì)胞被成功剪切后下一代芽隨即旋轉(zhuǎn)至“瓶頸”中（三個樣本分別為相鄰出芽、相對出芽、隨機出芽三種模式）。最終測定實驗的雙倍體菌株的復(fù)制壽命為24.29±3.65代。實驗人員統(tǒng)計了不同時間點下，母細(xì)胞所產(chǎn)生的子細(xì)胞被空捕獲結(jié)構(gòu)所捕獲后測定的壽命。擬合曲線顯示壽命較大的母細(xì)胞所產(chǎn)生的子代壽命會縮短。
同時，釀酒酵母的細(xì)胞周期在其壽命內(nèi)的分布也呈現(xiàn)一定規(guī)律。細(xì)胞在完成第一個細(xì)胞周期的用時比接下來5代用時略長，而接下來的復(fù)制壽命里，各代周期皆相對平穩(wěn)，只在臨近死亡的最后幾代中急劇上升。選取樣本并將其每個細(xì)胞周期使用不同顏色的長條標(biāo)出，從而將細(xì)胞群體間的異步化結(jié)果變得可視化。
結(jié)果表明，細(xì)胞在前8至10代以內(nèi)，細(xì)胞周期在細(xì)胞相互間保持有相對的同步性，隨著細(xì)胞不斷衰老，細(xì)胞間的異質(zhì)化現(xiàn)象逐漸明顯。臨近細(xì)胞死亡時，細(xì)胞的周期被拉長，且細(xì)胞間差異逐漸擴大。
視頻3：單個釀酒酵母細(xì)胞復(fù)制壽命的時序監(jiān)測
A 雙倍體釀酒酵母細(xì)胞的復(fù)制壽命曲線
B 不同時間點下，母細(xì)胞所產(chǎn)生的子細(xì)胞被空捕獲結(jié)構(gòu)捕獲后的復(fù)制壽命
C 釀酒酵母細(xì)胞的平均細(xì)胞周期（出生對齊）
D 釀酒酵母細(xì)胞的平均細(xì)胞周期（死亡對齊）
E 細(xì)胞周期分布圖
該研究后續(xù)工作包括利用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)深度學(xué)習(xí)算法實現(xiàn)酵母細(xì)胞的復(fù)制壽命、細(xì)胞周期、生長速率等關(guān)鍵生理指征參數(shù)的高效智能分析，成功解決酵母細(xì)胞衰老過程中的表型分析問題，為釀酒酵母復(fù)制壽命及其衰老相關(guān)形態(tài)變化完整關(guān)聯(lián)性圖譜的構(gòu)建提供可能，并在雜合性缺失、沉默信息調(diào)控等雙倍體細(xì)胞獨有的壽命調(diào)控模式研究上具有廣泛的前景。
在成像樣品制備以及圖像采集中的注意事項
實驗過程中，我們設(shè)定了每隔10分鐘對導(dǎo)航圖內(nèi)各典型區(qū)域一次成像。此外，F(xiàn)V3000系統(tǒng)配備了z軸防漂移系統(tǒng)，可持續(xù)鎖定焦平面，在長達3天的長時程成像中保證了焦面的穩(wěn)定。FV3000的導(dǎo)航圖和長時程鎖焦功能，優(yōu)化了我們的圖像采集工作流程，為實驗提供了便利性，保證了穩(wěn)定可靠的實驗數(shù)據(jù)的獲取。
參考文獻
[1] Smith, J., Wright, J., & Schneider, B. L. (2015). A budding yeast's perspective on aging: The shape I'm in. Exp Biol Med, 240(6), 701-710.
[2] Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H. E. W., Lee, L. P., & Heinemann, M. (2012). Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci USA, 109(13), 4916-4920.
